人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体构建、表达及纯化.docVIP

人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体构建、表达及纯化 　　[摘要] 研究提取人参叶中的总RNA，采用RT-PCR扩增人参叶Cu/Zn-SOD基因，构建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体。使用Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达。利用镍离子亲和层析进行纯化，并采用黄嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的酶活。经RT-PCR扩增的人参Cu/Zn-SOD基因序列与GenBank数据库中公布的高丽参Cu/Zn-SOD基因序列同源性为99.00%。经IPTG诱导，目的蛋白的表达量约为44.42%，相对分子质量为16.30 kDa。纯化后的蛋白酶活可达到10 596.69 U?mg-1。通过分子生物学方法，成功构建了人参pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体，为进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能奠定了基础。 　　[关键词]人参；Cu/Zn-SOD；原核表达 　　人参为五加科Araliaceae植物人参Panax ginseng C.A.Mey的干燥根及根茎，是我国名贵中药。现代研究表明人参中富含皂苷、挥发油、蛋白质、糖类、脂肪酸、无机??素等多种化学成分[1-2]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是一种能清除生物体内产生的超氧阴离子自由基（O2）的金属蛋白酶类[3]，广泛存在于一切生物体内。该酶具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗癌等多种药理作用[4-6]。SOD根据辅基部位结合的金属离子的不同，可分为Cu/Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD，其中Cu/Zn-SOD是平衡机体O2的主要蛋白[7-8]。以往对人参化学成分的研究大多集中于皂苷、糖类以及挥发性成分，而对人参Cu/Zn-SOD的研究报道很少。本研究从人参叶中克隆Cu/Zn-SOD基因，构建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD表达载体并诱导其表达，经镍离子亲和层析纯化目的蛋白，为探索人参Cu/Zn-SOD产业化工艺流程以及进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能提供试验依据。 　　1材料与方法 　　1.1人参 　　实验用吉林人参叶采自吉林农业大学人参种植试验田，经杨利民教授鉴定为五加科植物人参的叶。大肠杆菌Escherichia coli DH5α，E.coli BL21 （DE3），克隆质粒pMD18-T Vector，原核表达质粒pET-28（a）Vector，AMV逆转录试剂盒，限制性内切酶XhoⅠ，NcoⅠ，质粒提取试剂盒，DNA胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；TRizol Reagent购自Invitrogen公司；镍离子亲和色谱柱购自Qiagen公司。 　　1.2人参叶总RNA的提取[9] 　　将采摘的新鲜人参叶清洗后迅速放入液氮中，快速研磨成粉末。取100 mg粉末加入1 mL TRizol试剂，剧烈吹打混匀，低温静置5 min，加入200 μL氯仿，剧烈混匀，低温静置2 min，离心，吸取无色水相至另一EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，低温静置10 min，沉淀RNA，离心15 min。吸去上清，沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤，离心15 min，弃去上清，挥干乙醇，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA。 　　1.3目的基因片段的RT-PCR扩增 　　1.3.1特异引物的设计 根据Genbank中的高丽参Cu/Zn-SOD基因序列（AAB87572.1），设计基因片段的5′端和3′端，上游引物为5′-CATGCCATGGATGGTGAAGGCTGTCA-3′（标记部分为NcoⅠ酶切位点），下游引物为5′-CCCTCGAGACCCTGCAGCCCAATGA-3′（标记部分为XhoⅠ酶切位点）。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。 　　1.3.2RT-PCR扩增和测序 按照AMV逆转录试剂盒说明书进行操作，扩增目的基因。PCR参数为95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s循环30次，72 ℃ 8 min。使用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，经DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，与克隆质粒pMD18-T进行连接，构建克隆载体pMD18-T-Cu/Zn-SOD并转化至感受态E.coli DH5α中，筛选阳性菌落，委托北京华大基因公司进行测序。 　　1.4重组表达载体的构建[10] 　　将测序正确的重组质粒pMD18-T-Cu/Zn-SOD和pET-28（a）分别进行NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，将Cu/Zn-SOD与pET-28（a）进行连接，并转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，鉴定并筛选阳性克隆菌株。 　　1.5目的蛋白的表达 　　将阳性克隆菌株和含pET-28（a）空质粒对照菌分别接种到2 m