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棕色棉发育期儿茶素HPLC分析 　　摘 要：以棕色棉和白色棉为材料，利用HPLC法测定发育期种皮与纤维中儿茶素的组分与变化规律。结果表明：棉铃发育期，深棕ANL-1和泗棉3号种皮中有儿茶素单体EGC、C、EC，纤维中有GC、C。深棕ANL-1种皮中主要组分C的含量高于泗棉3号，且在28～35DPA阶段迅速下降。深棕ANL-1纤维中GC和C的含量均表现出先升后降的趋势。泗棉3号发育期纤维中各儿茶素组分含量水平非常低。初步推断在纤维伸长期，儿茶素等棕色素前体不断合成并积累，并在次生壁沉积期被逐渐氧化消耗而形成有色的棕色素。 　　关键词：棉花；高效液相色谱法；儿茶素；缩合单宁 　　中图分类号 S562 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）19-21-03 　　詹少华[1]利用纯化色素进行化学性质鉴定、波谱测定以及生理学指标分析，推断天然棕色棉纤维色素为单宁类氧化而来的醌类化合物，并根据前人生物合成途径的研究成果，总结和推断缩合单宁是通过莽草酸途径合成的儿茶素的聚合体。Ryser[2]通过薄层层析等试验方法，在棕色棉短绒里发现了单宁的前体儿茶素及单宁的衍生物，同时推测棕色纤维的颜色可能与位于液泡里的由儿茶素衍化的单宁作用有关，这正好验证了詹少华[1]的工作。但棕色棉与白色棉种皮与纤维发育期儿茶素单体成分及含量的变化规律如何，儿茶素与棕色素合成关系等报道较少。对于这些方面的研究将有助于我们进一步了解棕色棉纤维色素的合成机理。 　　笔者通过高效液相色谱法（HPLC）定性和定量测定了棕色棉和白色棉发育期种皮和纤维中儿茶素单体成分及含量变化，比较不同棉种中缩合单宁前体儿茶素的差异，以期为深入探讨棕色棉色素的合成机制提供一定的理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 以安徽农业大学生物物理实验室选育的品系深棕色棉“ANL-1”和白色棉“泗棉3号”为实验材料，于2012年5月种植于安徽农业大学农业园区内，常规管理，开花期选择发育正常、无病虫害植株的中上部果枝，上午9∶00～11∶00对当日花进行挂牌，每隔7d取棉铃，-70℃保存。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 儿茶素的提取 采用乙醇提取法[3]，分别取0.8g种皮与纤维，加少许石英砂和3mL 95%的乙醇研磨至匀浆状，5 000rpm离心10min，吸取上清，沉淀加3mL 95%的乙醇，再次离心。此法重复3次，最后95%的乙醇定容至10mL。加2倍体积水后，2倍体积乙酸乙酯萃取2次儿茶素。收集乙酸乙酯并在70℃左右减压干燥，得儿茶素粗品。色谱甲醇溶解并定容至1mL，稀释2倍，过有机滤头，进样。 　　1.2.2 儿茶素的HPLC分析及含量计算 几种儿茶素的组分采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）进行测定。色谱条件：色谱泵：Waters 600；控制仪：Waters 600；色谱柱：Phenomenex Synergi 4u Fusion 250×4.6mm；检测器：UV Waters 2487；灵敏度：0.01；检测波长：280nm；流速：1.2mL/min；进样量：5μL；每一试样进样之前，以流动相平衡15min。采用梯度洗脱条件A相：1%乙酸，B相：色谱纯乙腈，保留时间40min。洗脱具体条件见表1。 　　2 结果与分析 　　2.1 儿茶素的HPLC检测分析 分别取28DPA时的深棕ANL-1的种皮与纤维，以泗棉3号为对照，HPLC定性检测其中儿茶素单体成分，检测结果如图1～4所示，以标样色谱（图5）为参照：深棕ANL-1种皮中检测出EGC、C、EC，出峰时间分别在7.794min、9.22min、13.359min，峰面积为3 546、522 704、18 567。泗棉3号种皮中检测出EGC、C、EC，出峰时间分别在7.864min、9.305min、13.470min，峰面积为20 643、440 708、15 104。深棕ANL-1纤维中检测出GC、C，出峰时间在5.367min和9.272min，峰面积分别为20 316和19 449。泗棉3号纤维中检测出GC、C，出峰时间为5.395min和9.230min，峰面积为6 409和54 944。其他儿茶素单体成分难以检测到。故初步推断深棕ANL-1和泗棉3号种皮发育期儿茶素单体成分为EGC、C、EC，其纤维发育期儿茶素单体成分为GC和C。 　　3 结论与讨论 　　通过高效液相色谱的检测，分别发现了在棕色棉和白色棉发育期的种皮与纤维中存在着不同组分的儿茶素。这恰好与Ryser[2]的研究结果吻合，并进一步验证了詹少华[1]的工作。深棕ANL-1种皮中主要组分C的含量高于泗棉3号，且在28～35DPA阶段迅速下降，这与其所对应的