大肠杆菌自家灭活油乳苗制备及疫苗质量检验.docVIP

大肠杆菌自家灭活油乳苗制备及疫苗质量检验 　　摘要 大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验研究结果表明，按乳化剂的亲水亲油平衡值设计4个配方，通过对乳化剂粘度测定、乳剂类型测定、稳定性测定得出最佳乳化剂配方为90%白油、10%司本-80、2.0%吐温-80、1%硬脂酸铝。以此配方作为免疫佐剂，制备自家灭活油乳苗，并对其质量进行检验。经检验合格后，采用流行病学方法评价疫苗的免疫接种效果。结果表明，自家苗对试验动物小白鼠有保护力。 　　关键词 大肠杆菌；灭活油乳苗；制备；疫苗质量；检验 　　中图分类号 S852.5+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）05-0274-01 　　大肠杆菌为肠杆菌科、埃希菌属，兼性厌氧菌，为革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。由Echerich于1885年发现。在相当长的时期内，一直被视为正常菌群。直到20世纪中叶，人们才认识到一些特殊血清型对人和动物有致病性。大肠杆菌血清型较多，各血清型之间没有交叉免疫力，菌株易发生变异，因此市售大肠杆菌疫苗无法覆盖所有致病性大肠杆菌血清型。自家疫苗针对性强，在未引入外来畜禽前能收到较好的免疫效果。因此，及时分离到菌株，制取自家灭活疫苗来免疫畜禽是一种经济、效果好的预防致病性大肠杆菌的措施。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 主要试剂。营养肉汤、Minca培养基、麦康凯培养基、硫乙醇酸盐（T.G）培养基、酪胨琼脂（G.A）培养基、葡萄糖蛋白胨水（G.P）培养基、白油、司本-80、吐温-80、硬脂酸铝、0.85%生理盐水，甲醛溶液，麦氏浊管。 　　1.1.2 仪器。胶体磨、电子天平、精密试纸、HY-8大容量振荡器、PGX型多段可编程光照培养箱、电热恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台、TDL-40B离心机、冰箱、离心管。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 乳化剂配方的优化。乳化剂配方设计 根据乳化剂的亲水亲油平衡值，固定亲油性乳化剂司本-80，改变亲水性乳化剂吐温-80，设计4种乳化剂配方（表1），并与等量生理盐水乳化。用乳化剂检验方法检验后确定最佳配方。 　　1.2.2 自家苗制备。①菌种毒力试验。将大肠杆菌接种于普通营养肉汤中培养24 h，用麦氏浊管法大概计算出含菌数，给小白鼠进行腹腔注射，观察小白鼠发病情况。②菌种复壮。将冻存的大肠杆菌菌种接种于普通营养琼脂板中，置37 ℃电热恒温培养箱中培养24 h。③菌种扩大繁殖及灭活。用接种环从普通营养琼脂板中挑取菌落接种于普通营养肉汤中混匀，置37 ℃电热恒温培养箱中培养24 h。按改良Minca培养基量的3%～5%接种于改良Minca培养基中，37 ℃通气培养6～8 h。根据麦氏浊法计算出含菌数大约为10亿个/mL。向菌液中加入0.3%～0.4%甲醛溶液37 ℃灭活24～48 h。④灭活检查。用接种环接种已灭活的菌液于麦康凯培养基中，观察有无细菌生长。⑤配苗。按优化出的乳化剂配方，依灭活菌液的量，采用剂在油中法来配制佐剂。将佐剂加热溶解，经121 ℃高压灭菌30 min，冷却后4 ℃保存备用。⑥乳化。量取灭活菌液250 mL，倒入胶体磨内，缓慢搅拌，边搅拌边缓慢加入佐剂250 mL，在胶体磨内高速乳化10 min。⑦分装。用已高压灭菌过的10 mL青霉素瓶分装。用石蜡封好口4 ℃保存备用。 　　1.2.3 自家苗质量检验。①剂型检验。用吸管吸取疫苗，滴几滴于水中，观察是否分散。②粒度检验。用显微镜直接观察颗粒是否均匀。③稳定性检验。在一个半径为10 cm的离心器中装油乳剂，3 000 r/min离心15 min不分层，相当于保存1年以上不破乳。④粘度检验。取内口直径为1.2 mm的吸管，在室温下吸满1 mL乳剂，垂直放出0.4 mL所需时间作为粘度单位，以2～6 s为合格，不得多余10～15 s。⑤无菌检验。取灭活苗1 mL，接种于T.G培养基上，于37 ℃培养3 d后，吸取培养物，分别接种于T.G和G.A斜面，每支0.2 mL，一支置37 ℃，一支置25 ℃。另取0.2 mL接种于G.P培养基，于25 ℃培养5 d，观察是否有细菌生长。⑥安全性检验。取10只18～20 g的小白鼠，每只腹腔注射疫苗1 mL，观察21 d。 　　1.2.4 疫苗免疫效果评价。取20只18～20 g的小白鼠，平均分为2组，每组10只，同等饲养条件。试验组每只腹腔注射疫苗0.2 mL，对照组每只注射生理盐水0.2 mL。14 d后，进行第2次免疫。7 d后对2组小白鼠进行强毒攻击，每只腹腔注射0.5 mL保存的大肠杆菌原液。 　　2 结果与分析 　　2.1 乳化剂配方的优化结果 　　按照王明俊[2]介绍的乳化剂检验方法，得出最佳乳化剂配方为90%白油、10%