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基于量子点赭曲霉毒素A sFLISA检测技术研究 　　摘 要： 　　建立了基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）双抗夹心荧光免疫检测（sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay，sFLISA）体系，包含多克隆包被抗体、生物素标记的多克隆检测抗体、量子点标记的链霉亲和素等，获得了sFLISA的最佳操作参数：包被抗体浓度2.5 μg/mL，检测抗体稀释500倍，量子点标记链霉亲和素稀释100倍。该方法在OTA浓度3.125～125 μg/L之间时，相对荧光强度和OTA浓度呈线性关系，回归方程为y=0.0206x+0.2018，R2=0.9924；加标回收率在90.1%～110.0%之间，变异系数均小于10%，能较好地进行赭曲霉毒素A的定量检测。 　　关键词：赭曲霉毒素A（OTA）；量子点；双抗夹心荧光免疫检测（sFLISA） 　　中图分类号：R155.5+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0102-04 　　赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的次级代谢有毒产物，属烈性的肝脏和肾脏毒素，并具有致癌、致畸和致突变性[1～3]。OTA广泛存在于各种食物中，花生、谷物及其副产品是OTA 的主要来源，此外，在可可、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、酒类中也存在OTA。这类毒素包括7种结构类似的化合物，其中毒性最大、对农作物污染最严重、分布最广泛的是OTA，OTA被证实有致癌、致畸、致突变的作用，还具有免疫抑制性，国际癌症研究机构LARC将OTA定位为2B类致癌物（即可能引起人类癌症的物质）[2，4] 。 　　OTA的产毒菌株广泛地存在于自然界中，在谷类和人血清等样品中都检出过OTA残留，严重危害人类的健康。由于OTA的危害性，各国都立法对食品中OTA的残留进行限定，至今已有多个国家制定了食品（1～50 μg/kg）和动物饲料（100～1 000 μg/kg）的OTA限量标准。及时进行检测和分析是预防和控制OTA危害的有效手段[5～7]。 　　量子点（Quantum dots，QDs） ，又称无机半导体纳米晶体，是一类由Ⅱ～Ⅵ 族（ 如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe 等） 或Ⅲ～Ⅴ 族（ 如InP、InAs 等） 元素组成的纳米颗粒，是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料。与传统有机荧光染料相比，具有很多优良的荧光性能，吸收光谱宽、发射光谱窄而对称，斯托克斯位移（Stoke’s shift） 大及较高的荧光稳定性和较长的衰减寿命[8～11]。现在，量子点是最重要的纳米材料之一，经常被用作生物标记及成像过程中的光学探针。 　　本研究利用多克隆抗体的强富集能力以及生物素-亲和素系统的放大作用，以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针，巧妙设计了一种灵敏度高、特异性强的赭曲霉毒素A的双抗夹心荧光免疫捡测（sFLISA）技术，为赭曲霉毒素A在食品安全等应用领域提供技术基础和参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂和材料 　　赭曲霉毒素A（中检维康，50 μg/mL，1 mL）；兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体（Global Biotech，250 μg/mL）；鼠抗赭曲霉毒素A抗体（生物素标记，Covalab，1 mg/mL）；量子点标记的链霉亲和素-605（QS605，武汉珈源量子点技术开发有限公司）；96孔酶标板（Thermofisher NUNC，黑色底透）。 　　1.2 主要仪器设备 　　多功能荧光酶标仪（SpectraMax M5）；6930型冷冻离心机（日本KUBOTA公司）；MS3涡流旋转振荡仪（德国IKA公司）；Eppendorf移液枪（0～200、0～1 000 μL）；冰箱[冷藏温度（4±1）℃]；恒温培养箱[（37±1）℃]。 　　1.3 sFLISA方法步骤 　　1.3.1 抗体包被 用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5 μg/L包被酶标板，每孔100 μL。42℃孵育5 h，倒去包被液，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。其中一孔不加包被抗体而加包被缓冲液，作为试剂空白。 　　1.3.2 封闭 用1× BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200 μL，37℃孵育1 h，倒去封闭液，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。 　　1.3.3 加待检样品 除试剂空白及另留1排孔作为阴性对照外，其余各孔加待测样品或倍比稀释的标准品各100 μL，阴性对照孔加100 μL的1× BSA-PBS，37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。 　　1.3.4 加生物素化抗体 除试剂空白孔外，其余各孔