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功能基因芯片在土壤微生态研究中应用 　　摘要：功能基因芯片是一项以编码各种微生物生理功能的基因为探针的前沿的微阵列技术，这种技术可以对环境样品进行快速、敏感的高通量检测。近年来，功能基因芯片日臻成熟，并在土壤微生态的研究中得到重视和应用，在有关各种生态系统中以及各种污染压力下的土壤微生物群落的结构和功能的研究中提供了大量信息。功能基因芯片的发展将有助于深入研究土壤微生态细节过程，描述微生物群落的生态功能网络，为预测微生物群落对环境压力的响应变化提供理论基础。 　　关键词：基因芯片；土壤微生态；功能基因；微生物群落 　　中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1672-1683（2013）01-0093-04 　　在自然微生态系统中，微生物群落在各项物质循环与能量循环中发挥着重要作用。庞大的微生物数量及其错综复杂的功能网络使得微生物资源的研究和有效利用具有很大的挑战性。在实验室条件中很难模拟微生物群落的自然生境，无法为微生物群落提供理想的生长环境，传统培养富集技术只能提供有限的微生物群落信息，而且实验周期较长。分子生物学技术则直接检测微生物的遗传物质基础――核酸，极大地减轻了对培养方法的依赖，由此显著促进了自然生境中微生物的监测和定性描述。功能基因芯片是新一代分子生物学检测技术，通过成千上万密集排列的核酸探针能够在短时间内分析大量的核酸分子。大部分以核酸为检测对象的技术仅提供微生物的系统发育学信息，而功能基因芯片的检测对象为微生物群落的功能基因。基因芯片技术作为无需培养的高通量检测技术，解决了传统分子生物学的低效率问题，以特异性和高度灵敏性来保证检测结果的准确性，而且可以定量检测目的基因。近十年来，功能基因芯片的发展很大地促进了有关土壤微生态的活动和多样性的研究[1]。土壤微生物有类群繁多、数量巨大、分布复杂、功能多样等特征[2]，而且现今，气候变化、工业化、城市化以及农业的发展对土壤生态系统产生不同程度的压力，土壤微生物的分布和功能在不断地发生变化，然而人们对此的了解还远远不足以预测微生物的演替充分利用微生物的功能，因此功能基因芯片在土壤微生态的研究中也得到越来越广泛的关注。 　　1功能基因芯片（微阵列）技术简介 　　1.1功能基因芯片原理 　　基因芯片技术作为新一代的核酸杂交技术，具有高密度、平行分析、双色测定和低背景值等优势，非常适合于检测自然环境中的微生物[3]。在此技术中，将大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA）以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜等载体上组成密集分子排列，再根据核酸互补杂交原理，与标记样品进行杂交；通过检测杂交信号的强弱，判断样品中靶分子的数量及组成[4]。功能基因芯片是包含有功能基因序列的微阵列，这些功能基因编码微生物的生物化学功能的相关蛋白质。 　　功能基因芯片可分为功能分类基因芯片和基因表达芯片，前者的目的主要是研究菌群是否具有一些涉及特定反应过程的基因，可知微生物群落的潜在功能，杂交靶标是菌群DNA的PCR产物；而后者用于研究这些特定功能基因的生理活性及其基因真实表达的情况，需提取环境样品的mRNA，其杂交靶标是菌群cDNA的PCR产物[5]。 　　1.2功能基因芯片探针、杂交及数据分析 　　制作功能基因阵列的基因探针必须根据具体所要研究的问题进行认真选择。制备功能基因探针的方法有3种：（1）用专一性引物从纯培养物的基因组DNA中扩增所需的基因片段或以载体特异性引物从含所需基因的载体质粒上扩增；（2）通过PCR从自然环境中获取所需基因片段；（3）使用寡核苷酸探针，根据数据库中的功能序列信息设计并合成较长的（50～70个碱基）寡核苷酸探针，固化在阵列上。 　　为了与固定的探针杂交，待测基因（DNA或mRNA）要经PCR、逆转录、末端标记等操作，成为标记有荧光染料或同位素的核酸分子。杂交后每个斑点信号强度通过计算机进行处理得到大量信息，并进行后续的数据分析工作。数据分析一般遵循的技术路线为生物多样性分析、群落组成和结构分析、与环境因子的相关性分析，以分子生态网络的建立。在生物多样性分析中，要根据检测到的基因数量计算出各项多样性指数，如丰度、均匀度，多样性等等，同时要把不同样品中特殊的、唯一的以及共有的基因找出来；在群落组成和结构分析中，可利用的方法有方差分析、聚类分析、除趋势对应分析（Detrended Correspondence Analysis，DCA）、响应比分析等多种方法；群落及环境之间的关系分析中，可通过典范对应分析、矩阵相关分析、方差分解分析（VPA）等方法进行研究；建立分子生态网络目的是为了更清楚地揭示微生物功能基因和相关群落之间的关系[6]。 　　1.3功能基因芯片发展 　　最初，功能基因芯片由89个PCR扩增探针组成，可以检测到纯培养物