不同成熟期桃品NAC基因遗传多样性研究.docVIP

不同成熟期桃品种NAC基因遗传多样性研究 　　摘要： 从11个桃品种嫩叶中分别提取基因组DNA，根据GDR数据库中NAC基因序列信息，设计特异引物，PCR扩增，对产物克隆测序。然后，使用DNAman软件进行核苷酸和氨基酸序列比对，使用ORF Finder获得开放阅读框和推导氨基酸序列，使用CDD工具进行蛋白质结构域分析，利用Blastp工具搜索同源蛋白，采用Mega软件绘制系统进化树。结果发现，NAC蛋白第16～140位存在1个NAC结构域，N端比较保守，C端则多样性比较高；核苷酸变异有SNP和Indel 2类，津柳早红和小白桃在第3外显子区SNP和Indel变异数量非常多，说明这2个品种的NAC基因结构具有独特性。蛋白比对发现，桃NAC与梅同源性最高，其次是鸭梨；进化树体现了物种的亲缘关系。结果表明，参试品种NAC基因存在比较丰富的遗传多样性，在保守区内的氨基酸变异可能影响蛋白的功能。 中国论文网 /1/viewhtm 　　关键词： 桃；NAC转录因子；成熟期；保守区；系统进化树 　　中图分类号： S662.101 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）22-0046-04 　　NAC转录因子是一类植物特有的转录调控因子，1996年Souer等首先从矮牵牛中克隆得到[1]，随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等中相继发现。研究表明，NAC转录因子在植物的生长发育、形态建成、激素调节以及对生物和非生物逆境的抗性等方面发挥作用[2]。NAC转录因子最主要的结构特点是N端含有高度保守的NAC结构域，由约150个氨基酸残基组成；C末端通常有简单的重复氨基酸序列，富含丝氨酸，苏氨酸、脯氨酸和谷氨酸，或者酸性氨基酸残基，具有转录激活功能。 　　有研究者指出NAC转录因子调控植物生殖器官成熟和衰老。2006年，Uauy等从小麦中分离了NAM-B 1，功能分析显示，它在野生小麦中加速植株衰老，促进叶片中营养物质向籽粒流动[3]。2011年，Balazadeh等从拟南芥中分离了ORS1，超表达ORS1转化拟南芥，加速了转化体衰老[4]。2013年，Zhou等从水稻中鉴定出OsNAP，发现它调控叶片衰老[5]。2014年，Kim等在拟南芥上发现NAC有调控衰老的功能[6]。2013年，Pirona等利用桃Contender×Ambra和NJWeeping×Bounty F2代分离群体、SNP检?y、遗传图谱构建、QTL定位、对候选基因的Sanger测序等技术，结合检测???位基因在子代中的分离比例等，认为NAC基因在控制桃果实成熟期中发挥重要作用[7]。笔者前期克隆了小白桃和它的早熟芽变品种津柳早红的NAC基因，发现二者核酸序列有多处差异，尤其是后者中核苷酸变异形成终止密码子，导致翻译提前终止（未发表资料）。那么，在其他不同成熟期的桃品种中，NAC基因结构是否存在多样性？为了解答这个问题，笔者从11桃品种中克隆了NAC基因，希望通过分析其结构，能找到一些NAC发挥功能的线索。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　2014年6月从天津学香果蔬有限公司（位于天津市西青区杨柳青镇大柳滩村）桃资源圃采集津柳早红、万寿红等11个桃品种（表1）的嫩叶，液氮速冻，带回实验室置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。 　　1.2 基因组DNA提取 　　采用北京康为世纪生物科技有限公司的复杂植物基因组DNA提取试剂盒基因组DNA。使用Nanodrop 2000检测核酸纯度和浓度。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测核酸完整性、洁净度和有无其他类型核酸污染。保留纯度和浓度符合要求的样品，分别于-20 ℃保存。 　　1.3 NAC基因的PCR扩增及测序 　　从GDR数据库（https：//）获取桃NAC基因序列信息，对5′UTR、外显子区和3′UTR，用Primer Premier 5设计特异引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系25 μL包括10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL（2.5 mmol/L），模板cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（20 μmol/L），Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL（5 U/μL），其余用PCR级纯水补充。反应程序：95 ℃预变性5 min；35个循环（94 ℃变性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸 2 min）；最后72 ℃延伸8 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的条带回收、纯化（Takara胶回收试剂盒），连接至pMD18-T载体，热激法转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆、摇菌，选取阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司测序。 　　1.4 核酸序列比对和生物信息学分析