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miR―126调控SKOV3卵巢癌细胞周期实验研究 　　[摘要] 目的 探讨miR-126对卵巢癌细胞株的细胞周期和形态的影响，评价miR-126靶向调控卵巢癌增殖侵袭的作用。 方法 体外培养人卵巢癌细胞株SKOV3，通过慢病毒包装miR-126并转染卵巢癌SKOV3细胞系，将其分为三组：转染miR-126表达组（SKOV3/LV3-has-miR-126组）、转染阴性对照组（SKOV3/LV3NC组）和空白对照组（SKOV3组），观察转染miR-126后细胞形态变化，并用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期，分析转染miR-126后细胞形态与细胞周期的改变情况。 结果 转染miR-126后卵巢癌细胞组短梭形细胞居多，片状伪足减少，这均不有利于肿瘤细胞的迁移。同时SKOV3组、SKOV3/LV3NC组、SKOV3/LV3-has-miR-126组S期细胞平均比例分别为（53.8±4.5）%、（55.2±4.2）%和（39.7±6.6）%，而G1细胞比例则分别为（43.2±13.2）%、（42.6±13.2）%和（55.6±13.2）%，可见SKOV3组和SKOV3/LV3NC组细胞S期和G1期细胞比例相近（P 0.05），而与其他两组比较，SKOV3/LV3-has-miR-126组的细胞S期增殖指数较低，而停留在G1的细胞比例则较高，两期比较差异有统计学意义（P 　　[关键词] miR-126；卵巢癌；细胞周期；侵袭 　　[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（a）-0021-04 　　卵巢癌是妇科常见肿瘤之一，其早期症状隐匿，因此约70%卵巢癌患者在确诊时已处于癌症晚期。卵巢癌具有较强的恶性生物学行为，易发生腹腔内的广泛种植，已成为影响妇女生命的最主要的肿瘤之一[1-2]。卵巢癌的侵袭转移而产生的各种并发症及器官衰竭是卵巢癌患者死亡的主要原因，目前卵巢癌的发生和发展机制尚未完全明确，而阐明其侵袭转移机制是卵巢癌根治的关键环节之一，因此，卵巢癌的侵袭转移机制已成为国内外研究的热点，一般认为恶性肿瘤的侵袭转移涉及肿瘤细胞从原发灶的脱离、蛋白酶水解周围基底膜以及肿瘤细胞迁移到蛋白酶水解部位等过程[3-5]，上述的肿瘤侵袭转移过程具有肿瘤血管依赖性，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体调控途径是肿瘤血管形成的最重要因素。郎景和课题组研究表明卵巢癌患者术前血清VEGF水平是影响卵巢癌预后的独立因素，且与卵巢癌的复发密切相关，VEGF表达水平升高是患者预后不良的标志[6]，因此如何从源头上抑制VEGF的表达无疑成为卵巢癌的有效治疗方法之一。 　　microRNA是真核细胞内的非编码微小RNA，大量研究表明miRNA与多种肿瘤的发生、发展密切相关，其可能发挥着抑癌基因或癌基因的作用[6-7]。miR-126是作为一种特异性表达的microRNA，是新近被鉴定的血管生成相关microRNA，它们来源于共同的前体结构，位于染色体9q34.3上EGFL7基因内含子中，少数情况下也可位于EGFL7基因外显子及部分非编码区域，研究证实miR-126通过VEGF mRNA 3UTR中的互补位点结合，在翻译水平抑制VEGF的表达[8-9]，它能够通过调控VEGF等基因的表达参与调控血管发育，新生血管形成以及血管炎性反应等血管的生理和病理生理过程[10]。研究表明miR-126可以抑制多种肿瘤的增殖和转移，如肺癌，乳腺癌，结肠癌等，提示miR-126可能具有潜在的抑癌基因作用，但其在卵巢癌中的作用尚未阐明[11-13]。本研究通过体外培养SKOV3卵巢癌细胞株，同时通过慢病毒转染miR-126的基因，复制SKOV3卵巢癌细胞株miR-126过表达模型，以探讨miR-126对卵巢癌细胞株的细胞周期及细胞形态改变的影响，评价miR-126靶向调控卵巢癌增殖侵袭的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞培养 　　SKOV3细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，将SKOV3细胞移入培养瓶中，加入新鲜培养液，适当稀释细胞（含细胞的冻存液：新鲜培养液=1?9），放置CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后换液去除二甲亚砜（DMSO）；或者将细胞低速离心（1500 r/min，5 min）以直接去除含DMSO的培养液，然后加入新鲜培养基，轻轻吹打接种到培养瓶中。 　　1.2 慢病毒转染 　　miR-126质粒构建和慢病毒包装由上海吉玛制药技术有限公司完成，参照慢病毒说明书，取对数生长期细胞，接种于6 cm培养皿，每孔细胞数为3×105个，加2 mL全培养基培养，24 h后待细胞长至80%～90%融合时，用2 mL无血清培养基洗细胞1次