地塞米松对成牙骨质细胞增殖和矿化功能调节作用.docVIP

地塞米松对成牙骨质细胞增殖和矿化功能调节作用 　　[摘要]目的：研究不同浓度地塞米松对成牙骨质细胞增殖、矿化能力的影响。方法：本研究设3个实验组和1个对照组，对体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30分别加入1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L的地塞米松作为实验组，对照组不加药。72h后提取细胞总RNA，用实时荧光定量PCR（Q-PCR）方法检测成牙骨质细胞矿化相关基因mRNA表达的变化。CCK-8法检测地塞米松对成牙骨质细胞增殖的影响，采用碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色对地塞米松作用后成牙骨质细胞生物学特性作初步观察。结果：地塞米松在高浓度时有抑制成牙骨质细胞增殖的作用。和对照组相比，实验组ALP活性增高，矿化结节形成明显增多，Q-PCR结果显示与细胞矿化相关基因 ALP、BSP、OCN、Runx-2 mRNA表达与对照组相比明显增高。结论：地塞米松可以增加成牙骨质细胞矿化功能，并可能由此影响牙根吸收和修复过程。 　　[关键词]成牙骨质细胞；地塞米松；牙根吸收与修复 　　[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）13-1071-05 　　牙周组织再生包括牙周膜、牙槽骨和牙骨质的再生。成牙骨质细胞是牙周组织中牙骨质形成重要的功能细胞，在牙根形成、牙周病牙骨质修复及牙根吸收与修复过程中起着关键性作用，其主要功能是形成牙骨质基质[1]。地塞米松是一种有效的类固醇骨刺激因素，它能够促进成骨细胞分化，促进骨生成[2-3]。成牙骨质细胞和成骨细胞同样作为矿化组织的分泌功能细胞，并且也有可能来源于同一前体细胞[4]，地塞米松是否在成牙骨质细胞分化中有着相似的功能和作用呢？本研究旨在探讨地塞米松对成牙骨质细胞粘附及矿化功能的影响，为临床牙骨质再生提供新的思路和方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 细胞株：成牙骨质细胞株 OCCM-30由四川大学口腔医学实验中心馈赠。 　　1.1.2 实验试剂：地塞米松、茜素红、β-甘油磷酸钠，（Sigma，美国）；胎牛血清、α-MEM培养基（Gibco，美国）；Tripure，Q-PCR试剂盒（Roche，瑞士）；逆转录试剂盒（Fermentas，加拿大）；CCK-8试剂盒（南京凯基公司）；ALP试剂盒（南京建成公司）。 　　1.1.3 实验仪器：PCR仪（Bio-Rad，美国）；MX3000P荧光定量PCR扩增仪（Stratgene，美国）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 实验分组和处理：将同步化生长的成牙骨质细胞随机分为4组。细胞以3×104/孔接种于6孔板中，24h后，分别加入1×10-5mol/L、1×10-6 mol/L、1×10-7mol/L的地塞米松，并设置空白对照组，隔日换液。 　　1.2.2 CCK-8法检测地塞米松对成牙骨质细胞活性的影响：将成牙骨质细胞按3×103个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后分别更换为含不同浓度地塞米松的α-MEM培养液，同时设不含地塞米松的空白对照组。继续培养24、48、72h后，各孔加入CCK-8溶液10μl，37℃下孵育2h，酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度值。 　　1.2.3 地塞米松对成牙骨质细胞矿化功能的影响 　　1.2.3.1 碱性磷酸酶（ALP）活性检测：在各组孔板中加入细胞裂解液覆盖满细胞，将细胞裂解后从中取30μl按照说明书操作在酶标仪520nm波长处测定各孔吸光度，同时测定其蛋白浓度，并按公式计算出ALP浓度。 　　1.2.3.2 矿化染色：成牙骨质细胞继续培养7天后，经4%多聚甲醛室温固定30 min、2%茜素红溶液（PH=8.3）染色30 min后，镜下观察矿化结节的形成情况。每孔加1.5ml 0.5N HCl含5% SDS溶液溶解着色的矿化结节30min后于405 mm波长酶标仪上测各孔吸光值。 　　1.2.3.3 Q-PCR检测成牙骨质细胞矿化相关基因的表达情况：将各组细胞培养3天后，收集样本，提取总RNA，RT-PCR试剂盒进行逆转录。将逆转录得到的cDNA在MX3000P实时荧光定量基因扩增仪上进行PCR扩增。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（见表1）。扩增条件如下：变性95 ℃10 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃20s共扩增40个循环数。收集数据，将各样本目的基因的阈值循环数（threshold cycle，Ct）值，与GAPDH基因的Ct值进行比较，得出待测样品的相对拷贝数。 　　1.3 统计学分析：应用SPSS l7.0统计学软件对所得实验数据进行单因素方差分析，并比较各组间差异，P 　　2.2.2 矿化结节形成：各组细胞培养8天后进行茜素红染色，实验结果显示，实验组与对照组相比，矿化结