特殊组织DNA提取和鉴定.docVIP

特殊组织DNA的提取及鉴定1、提取DNA的简易方法:1)、从全血中提取DNA：取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的ddH2O混匀后，12000rpm离心2分钟，弃上清，（若沉淀中仍 有红细胞,需重复此操作1-2次）加入样品提取液20μl,混匀,100℃煮10分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟,取上清2μl进行扩增。2)、从其它有核细胞中提取DNA：可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精子、组织碎片等有核细胞的管中,100℃煮10分钟（可在扩增仪上进行）后12000rpm离心5分钟，取上清进行扩增。2、从全血中用有机溶剂提取DNA：1）试剂??a.10%SDS??b.2.0M醋酸钠??c.20mg/ml蛋白酶K??d.苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)??e.分析纯乙醇??f.TE(10mM Tris,1.0mMEDTA溶液,Ph7.5)2）步骤??A、血液样本收集于含EDTA的抽血用管子中，样品用手倒转试管混合后等分。每份700μl全血可放在1.5ml的塑料离心管中，-70℃储存。??B、在解冻的（或液体的）血液中加入800μl的TE并混匀，12000rpm离心2分钟。??C、吸取1.0ml上清液并弃去。??D、加入1.0mlTE,振荡后离心2分钟,去除尽可能多的上清液,但不要影响沉淀。??E、向沉淀中加入：375μl 2M醋酸钠; 25μl 10%SDS;5μl 蛋白酶K溶液。略加振荡，于56℃保温一小时。??F、加入120μl苯酚/氯仿/异戊醇，振荡30秒。??G、12000rpm离心5分钟。??H、小心移出水相（上层）到一新的1.5ml的离心管中。??I、向水相中加入2.5倍体积预冷的分析纯乙醇，倒转试管加以混合，将试管于-20℃下放置10分钟以上。??J、12000rpm离心10分钟。??K、倾去酒精，用移液器小心吸去剩余酒精，不要触动沉淀。??L、加180μl TE 后振荡。加20μl2M醋酸盐，手工混匀。??M、加500μl预冷分析纯酒精，用手轻轻混匀，12000rpm离心10分钟，倾去上清液。??N、用室温下的70%酒精1ml洗涤DNA沉淀,12000rpm离心5分钟，倾去上清液。 ??O、用移液器吸去残余的酒精，管子置于真空离心抽除残余的酒精（大约10分钟）。或将管子放在100℃以下烘干。??P、加200μl TE于DNA沉淀中，混匀后于4℃保温过夜（或56℃溶解DNA 2小时以上），次日清晨振荡10秒。3、从斑痕材料中用有机溶剂提取DNA1)试剂??a.斑痕抽提缓冲液（1.21g Tris,5.84gNaCl,6.02g二硫苏糖醇，? ???2%SDS,10mMEDTA/升,Ph8.0）??b.其它试剂见2.1)2)步骤A、将斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料离心管中。B、加400μl斑痕抽提缓冲液及10μl蛋白酶K溶液，混匀，离心数秒使碎片浸入液体。C、于56℃保温过夜。D、用一新的灭菌牙签将碎片中的液体拧干后从管中取出。E、加500μl苯酚/氯仿/异戊醇，手摇混匀，12000rpm离心3钟。F、将上清液转移到新的离心管。G、上清液中加入2.5倍体积预冷的分析纯酒精。H、手摇混匀试管中的各种成分，放置-20℃10分钟以上。I、12000rpm离心10分钟。J、倾去酒精。K、用1ml室温的70%酒精洗涤。L、12000rpm离心5分钟。M、倾去酒精，用移液器吸去残余酒精。N、真空离心10分钟除去残余酒精，或在100℃以下烘干.O、56℃下用36μl TE溶解DNA，时间至少2小时。4、从精斑中分离提取DNA??1）试剂??a.TNE缓冲液（1.21g Tris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升）??b.20%sarcosyl??c.0.39M二硫苏糖醇??d.其它试剂见2.1)??2)步骤??A、从棉签上取下有检材的棉花并置于1.5ml塑料离心管中。??B、管中加入400μl TNE缓冲液；25μl 20%sarcosyl;75μl水；5μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37保温2小时。??C、用一新的灭菌牙签将棉花拧干后从管中取出，再用12000rpm离心5分钟。??D、移上清液（内含裂解细胞或雌性片段）于一新的1.5ml管，不要振荡沉淀物（内含非裂解细胞或精子）。再用TNE洗脱沉淀物四次。 ??E、在有沉淀的管中加入10μlTNE;50μl20%sacrosyl;40μlDTT;150μl水；10μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37℃保温2小时。??F、按3，2）E～O的方法分别抽提出两管中的雌性DNA和精子DNA。5、用Che