第二十一章 常用分子生物学技术原理及应用 - 齐医精品课程.docVIP

PAGE PAGE 2第二十一章 常用分子生物学技术的原理及其应用【大纲要求】一、掌握 PCR技术的原理与应用。基因诊断的概念与特点；基因治疗的概念。二、熟悉 分子杂交与印迹技术。基因诊断的常用技术方法；基因治疗的基本程序。三、了解 核酸序列分析、基因文库、疾病相关基因的克隆与坚定；遗传修饰动物模型的建立及应用、生物芯片技术、蛋白质相互作用研究技术；基因诊断的应用、基因治疗的应用与展望。【重点及难点提要】一、重点难点 1．重点：分子杂交与印迹技术，PCR技术的原理。基因诊断与基因治疗的概念。2．难点：PCR技术的原理。基因诊断常用技术及治疗的基本方法。二、教学内容概要本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的常用技术。 分子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性、印迹技术、探针技术。印迹技术定义为：将在凝胶中分离的生物大分子转移(印迹)或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。印迹技术包括DNA印迹技术(Southern blotting)、RNA印迹技术(Northern blotting)、蛋白质印迹技术(Western blotting)。探针是指用放射性核素或其他化合物标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用于检测核酸样品中的特定基因。 PCR技术是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸。PCR技术主要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定和基因突变分析等。测定DNA序列技术包括手工测定和自动化测定，其原理均建立在化学裂解法和DNA链末端合成终止法的基础之上。目前，DNA自动测序已基本取代了手工测序。 基因文库可分为基因组DNA文库和cDNA文库。基因组DNA文库是指包含某一个生物细胞全部基因组DNA序列的克隆群体，它以DNA片段的形式贮存着某一生物全部基因组DNA信息。cDNA文库是指包含某一组织细胞在一定条件下表达的全部mRNA反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。目前克隆致病相关基因主要有功能性克隆和定位克隆两大策略。转基因动物、动物整体克隆技术、基因剔除技术在建立疾病的动物模型，探讨疾病的发生机制方面具有重要价值，更为重要的是可以作为新的治疗方法和新的药物的筛选系统。生物芯片技术包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片主要用于基因表达检测、基因突变检测、功能基因组学研究、基因组作图、杂交测序和新基因的发现等多个方面。蛋白质芯片广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质间的相互作用的研究。 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、各种亲和分析、荧光共振能量转换效应分析、噬菌体显示系统筛选等等。酵母双杂交系统是目前分析细胞内未知蛋白质相互作用的主要手段之一。人类大多数疾病都与基因密切相关，主要因内源基因的变异和外源基因的入侵使得基因的结构变异和表达异常所致，在基因水平诊断和治疗疾病是现代医学发展的趋势。 基因诊断是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。常用的方法建立在核酸分子杂交和PCR技术的基础上。以分子杂交为基础的方法包括限制性内切酶酶谱分析法、DNA限制性片段长度多态性分析法、等位基因特异寡核苷酸探针杂交法等。 基因诊断已广泛地应用于遗传病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等重大疾病，除在早诊早治、疗效判断、鉴别诊断、分期分型、预测预后中发挥作用外，在判断个体疾病易感性、器官移植组织配型和法医学等方面均起着重要作用。基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。目前基因治疗常用的方法有基因矫正、基因置换、基因增补和基因失活等。基因治疗根据受体细胞种类的不同分为体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗。迄今为止进行的基因治疗都是体细胞的基因治疗。 目前基因治疗已逐步从实验室过渡到临床，且已取得了喜人的成绩。但基因治疗作为一种新兴的学科，尚存在许多理论和技术上的问题，有待在发展过程中进一步完善。【自测题】一、选择题【A型题】1．在加热或紫外线照射下，可导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中所有的共价键则不受影响，称为A．DNA变性 B．DNA复性 C．DNA重组 D．DNA杂交 E．DNA退火2．DNA变性的本质是下列哪种键的断裂A．盐键 B． 氢键 C．离子键 D．共价键 E．以上都不是3．一般影响核酸变性的温度可选在A．50－60