分子生物学实验操作方法与技巧2.pptVIP

质粒DNA的碱裂解法小量制备（3） 2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。 盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面 均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。  3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。 盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后 将管置于冰上3－5分钟。  质粒DNA的碱裂解法小量制备（4） 4）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。 5）可做可不做：加等量酚：氯仿， 振荡混匀， 用微量离心机于4 ℃以12000g离心 2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。 6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合， 于室温放置2分钟。 7）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。 8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。 9）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。 i.此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。 ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶， 在适宜温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。 iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物。 质粒DNA的煮沸法小量制备  1）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。 STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 5% Triton X-100 2）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。 3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。 4）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。 5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。 6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。 7）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。 8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。 9）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。 10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。 11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。 注：当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA 株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育时质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤9）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。 碱裂解法提质粒中常见问题及可能原因 碱裂解法和煮沸法都极其可靠，重复性也很好，而且一般不会遇到麻烦。但我仍然强烈推荐碱裂解法而一般不要用煮沸法。多年来，在我们实验室中日常使用碱裂解法的过程中，只碰到过以下几个问题： (1)有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果问题依然存在，可用离心柱层析法（Kit）纯化DNA。 (2)在十分偶然的情况下，有些人的制备物会出现无质粒DNA的现象。这多数情况下是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去，有时是因为试剂配制有问题（如成分、浓度或pH错误等）。(3)提取的质粒DNA呈涂布状或弥散状(Smear状)：操作过程中用力过猛，动作过大或操作过程中试剂被污染。 质粒DNA的大量碱裂