第二章基因工程原理及其在食品工业中的应用xjno5.pptVIP

* * * （三）cDNA文库法 指汇集以某种生物体成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。 （四）PCR法 一般经典的PCR法可用于已知核苷酸序列核酸片段的特异扩增；而一些改进的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特异扩增。 * 二、目的基因与载体的重组（重组体的构建） 基因重组（gene recombination）：利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，并将两者连接起来。 目的基因和载体的连接分为黏性末端连接、平末端连接、人工接头连接和同聚物加尾连接。 * （一）黏性末端连接 1.同一限制酶切位点连接 由同一限制酶切割的不同DNA片段具有相同的末端，当这样的两个DNA片段一起退火时，黏性末端单链间进行碱基配对，然后在T4DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。 * * 2.双酶切片段的定向克隆 以两种不同的限制酶切割目的基因，使之产生两个不同黏端，对载体同样以这两个限制酶切割，达到载体DNA和外源DNA片段自身两端为非同源的黏端，此时载体和外源DNA片段都不会发生自身环化，而且只有在DNA连接酶的作用下，载体DNA和外源DNA片段以两端互补实现DNA定向插入。优点： （1）外源DNA只能以一个方向插入到重组质粒，以便目的基因的正确转录和表达。 （2）由于不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数是携带有目的基因的重组质粒。 * * 3.不同限制酶切位点连接 配伍末端（compatible end）：由两种不同的限制酶切割的DNA片段、具有相同类型的黏性末端。 同尾酶（isocaudamers）:来源不同，能够对DNA切割产生相同的黏性末端，而其识别序列的特异性不同。 同尾切割可以产生完全配伍（互补）的黏性末端，便于两个DNA片段的连接。 同裂酶（isoschizomers）：来源不同，具有相同识别序列，但切点不同。 经过同裂酶切割过的DNA与载体连接前可能还必须进行前处理。 * 2.平端连接 具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接。在一定的反应条件下，可用T4DNA连接酶将平齐末端的DNA片段有效地连接起来。 3.人工接头连接 人工接头：人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点，应用相应的内切酶切割，就可以分别得到互补的黏性末端。 * * 4.同聚物加尾连接 利用同聚物序列之间的退火作用完成连接。末端转移酶在DNA片段的3’末端添加同聚尾造成延伸部分。末端转移酶不具有特异性，在4种dNTP中任何一种均可作为前体物，可以产生由单一核苷酸所构成的3’同聚物末端。 * * 三、将重组体导入受体细胞（重组转化体的获得） 转化（transformation）：将重组质粒导入受体细胞，使受体菌遗传性状发生改变的方法。 转染（transfection）:将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。 根据受体生物，一般可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法和动物细胞转化法。 * 1.氯化钙转化法 首先将对数生长期的大肠杆菌悬浮于冰预冷的低渗氯化钙溶液中处理，使细胞膜通透性增加，然后加入重组DNA，使DNA与钙离子形成复合物，吸附于细胞表面，经42℃短暂的热处理，促进外源DNA进入宿主细胞。 2.转染 首先将重组的λ噬菌体DNA或柯斯质粒DNA体外包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒，然后经由在受体细胞表面的λ噬菌体接受器位点使这些重组体DNA注入大肠杆菌宿主细胞。 * 四、重组转化体的筛选和鉴定 （一）利用表型特征进行筛选（遗传检测法） 表型：指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。 1.利用载体提供的表型特征进行筛选 （1）抗药性标记基因插入失活筛选法 （2）β－半乳糖苷酶显色反应筛选法。 2.利用外源DNA提供的表型特征进行筛选 要求外源DNA是一个完整的基因，而且能够在大肠杆菌或其他受体细胞中实现功能表达。 * 3.利用噬菌斑的形成进行筛选 以λ噬菌体载体与外源DNA构建的重组体的筛选主要依赖于重组体的大小及形成噬菌斑的能力。 重组体DNA只有在为野生型λ噬菌体DNA的75%～105%的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而