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滴水珠原生质体分离纯化与植株再生 　　[摘要] 以滴水珠的幼嫩叶片为材料，对影响原生质体分离纯化、培养及植株再生的因素进行了研究。结果表明：适合滴水珠叶片的酶解体系为13% CPW（细胞原生质体洗液）+1.0% 纤维素酶+ 0.1% 果胶酶，pH 6.0，适宜酶解温度为25～28 ℃，酶解时间为4 h；滴水珠叶肉原生质体纯化以上浮法蔗糖梯度离心效果最佳，以25%的蔗糖做梯度材料，500 r?min-1离心10 min；用于培养滴水珠原生质体的培养基为MS+0.5 mg?L-1 6-BA+0.25 mg?L-1NAA 13%甘露醇，培养3 d有细胞分裂启动迹象，30 d左右形成愈伤组织，转移至MS +0.5 mg?L-1 6- BA+0.25 mg?L-1NAA固体培养基上增殖培养，并继代数次，5～6个月后愈伤组织可分化出芽并再生植株。 　　[关键词] 滴水珠；原生质体分离；植株再生 　　植物原生质体是指去除了全部细胞壁的细胞，或是一个被质膜所包围的具有生活力的“裸露细胞”；是植物遗传工程的理想受体和细胞生物学与遗传学等基础理论研究的理想材料[1]。滴水珠为天南星科半夏属植物心叶半夏Pinellia cordata N.E.Br的干燥块茎，具有解毒消肿，散瘀止痛等功效，常用于毒蛇咬伤、肿毒、头痛、胃痛、跌打损伤等。滴水珠具有良好的药理作用，因此受到了广泛的关注。国内外学者对其在人工栽培及生物学特性等方面做了研究，但对滴水珠原生质体的分离与植株再生的报道较少[2-4]。本研究以滴水珠叶片为材料，探讨了影响原生质体分离、培养的因素，并培养获得愈伤组织，建立滴水珠再生体系，为滴水珠原生质体遗传转化和细胞融合提供科学依据。 　　1 材料 　　滴水珠幼嫩叶片，采自浙江临安，由浙江中医药大学生命科学学院丁志山教授鉴定。 　　2 方法 　　2.1 酶液的配制 　　13% CPW：27.2 mg?L-1 KH2PO4，101.1 mg?L-1 KNO3，1.66 mg?L-1 KI，1 110.0 mg?L-1 CaCl2，246 mg?L-1 MgSO4.7H2O，0.255 mg?L-1 CuSO4?5H2O，130 g?L-1甘露醇，115 ℃，高压灭菌30 min，备用。在无菌CPW中加入纤维素酶和果胶酶，将pH调至5.8，经0.2 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。 　　2.2 原生质体的分离、纯化及活力测定 　　2.2.1 材料预处理 将滴水珠幼嫩叶片置于4 ℃冰箱中，黑暗预处理24 h，然后取0.5 g，用眼科剪各剪成1 mm×1 mm见方的碎片，置于13% CPW +1.0% 纤维素酶+1.0% 果胶酶的pH为6.8的混合酶液中，25 ℃慢速摇床（50～60 r?min-1）上黑暗酶解，重复3次。酶解产物经200目尼龙网依次过滤，700 r?min-1离心5 min，用新鲜洗液洗涤3次，收集原生质体，纯化后进行原生质体产量和活力的统计。 　　2.2.2 最佳酶液的筛选 采用正交试验L9（34）对酶液酶种的组成、用量及pH进行优化考察，重复3次，见表1。 　　酶解产物经200目尼龙网依次过滤，700 r?min-1离心5 min，用新鲜洗液洗涤3次，收集原生质体，纯化后进行原生质体产量和活力的统计。 　　2.2.3 酶解温度和酶解时间的筛选 最佳酶解液酶解2 h后，每隔1 h在倒置显微镜下观察原生质体酶解情况并计数，直至8 h；最佳混合酶液分别设定20，25，28，30，33 ℃ 5个温度梯度，测定不同温度下原生质体的分离和收集情况。每个处理重复3次。 　　2.2.4 原生质体的纯化条件优化 采用蔗糖等密度离心法的上浮法对原生质体进行纯化，蔗糖浓度设定为25%，30%，35%（115 ℃高压蒸气灭菌30 min），洗涤后的原生质体用1 mL洗液悬起，轻轻铺于3 mL蔗糖上层，设定3个离心条件500 r?min-1，10 min；700 r?min-1，7 min；1 000 r?min-1，5 min，离心后用无菌滴管小心吸取中间条带。 　　2.2.5 原生质体计数和活力测定 采用血球计数板计数，每个样本重复计数5次，每个处理重复3次。 　　原生质体密度=16个大格内原生质体总数平均数×104×稀释倍数； 　　原生质体产量=原生质体密度（个/mL ）×稀释后体积（mL）/叶片质量（g） 　　FDA染色：取纯化并清洗后原生质体悬浮液，置于小离心管中，加入现配的FDA丙酮溶液使其终浓度为1.5～2 mg?L-1，混匀置于暗处2 min，700 r?min-1离心5 min，弃去上清，沉淀用13% CPW悬起并稀释至适宜浓度，用荧光显微镜（OLYMPUS 1×71）观察并拍照，用蓝色激发光激发，发绿色荧光的为有活力的原生质体，发红色荧光的为