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浅析PCR技术在食品检验中应用 　　[摘 要]食品行业属于环环相扣的生产、运营过程，食品不可避免在生产、流转及销售等环节受到各类微生物的污染，影响品质，因此我国实行微生物检测是监督食品安全的重要手段。PCR技术凭借其操作便捷、检测快捷及准确率高等优势，为我国食品行业的发展及国民身体健康奠定保障。因此，PCR技术的应用不仅利于民生基础设施，且利于我国与国际间的贸易发展，具有重要意义。 　　[关键词]PCR技术；食品检验；聚合酶；DNA 　　中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）27-0385-01 　　1.常规PCR检测 　　常规PCR检测原理是在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液和MgCl2溶液的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火（复性）、延伸等三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。其三个基本反应步骤为：（1）模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；（2）模板DNA与引物的退火（复性）模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸DNA模板―――引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这就完成了一个PCR循环，新合成的链都可作为下一次反应的模板，因此扩增产物的量是以指数级方式增加。 　　2.多重PCR 　　多重PCR是PCR技术的一种，是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，同时扩增多个目的基因或DNA序列。首先将双链DNA热变性成单链DNA，然后，人工合成的引物与单链DNA靶序列结合，在4种碱基dNTPs底物存在下，在DNA聚合酶作用下，引物沿着DNA单链从5′末端到3′末端方向延伸，合成新的双链。新合成的双链又作为模板，重复上面的聚合酶反应，合成新的DNA双链，经过20～35个循环扩增出大量拷贝。 　　2.1 多重PCR的特点 　　高效性；系统性；经济简便性。 　　2.2 多重PCR在食品微生物检测中应用 　　（1）多重PCR在食品病原微生物检测中的应用。食品污染的病原菌主要包括肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、耐药球菌等，在检测这些微生物过程中，很容易受到其它微生物和本身变异株的干扰，造成假阳性和准确率不高的现象。目前，越来越多的研究使用多重PCR检测这些病原菌。（2）多重PCR在食品非致病菌检测中的应用。乳酸菌（LAB）是真空环境下的主要微生物，真空食品包装中的乳酸菌含量一般很低，但它可以在储藏过程中繁殖。采用多重PCR方法检测真空包装中的微生物对检测食品腐败有重要意义。（3）多重PCR技术在食品微生物检测中存在的问题。多重PCR在食品微生物的检测中可能存在多对引物之间的相互抑制，引物与非靶序列的结合产生非特异性扩增。因此，在多重PCR的应用中，如何合理设计引物，优化最佳多重PCR体系及反应条件可以减少非特异性扩增、假阴性、假阳性结果。 　　2.3 RT-PCR 　　逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的原理是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。 　　2.4 巢式PCR 　　巢式PCR（nestingPCR）是指先后用两套引物进行扩增的PCR技术，用内外两对引物先后扩增靶基因片段。通常是先用第一套引物扩增15～30个循环，再用已扩增的DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环。 　　2.5 免疫-PCR 　　免疫-PCR由Sano等首创，是指用DNA分子作为标记物，在做一般的免疫反应的同时进行PCR扩增和电泳分析的免疫试验。在免疫-PCR中，多用生物素作为连接分子。生物素具有两个独立的结合位点，一个可与DNA分子结合，另一个能与抗原2抗体复合物上的亲和素结合，由此将DNA分子和抗原-抗体复合物专一性地连接在一起，形成抗原-抗体-亲和素-生物素-DNA复合物，然后加入PCR扩增系统，标记的DNA便可。 　　2.6 荧光定量PCR 　　实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术（FRET）应用于常规多聚酶链式反应仪中，通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移