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转录因子Smad5基因克隆及表达载体构建 　　[摘要] 目的 通过转录因子Smda5基因克隆以及真核表达载体的构建，为以后研究转录因子Smad5在牙釉质发育的分子调控方面奠定基础。方法 根据引物设计原则设计Smad5基因的PCR引物， 以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得cDNA为模板，进行PCR扩增，用PCR法扩增得出含有KnpⅠ和XbaⅠ的Smad5目的基因连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上。结果 经过PCR引物扩增得到1419bp基因片段，将获得的重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Smad5双酶切分析鉴定，测序结果与GenBank登录基因完全一致。结论 成功实现了Smad5基因克隆及表达载体的构建，为以后研究转录因子Smad5在牙釉质发育的分子调控方面奠定基础。 　　[关键词] 转录因子Smad5；基因克隆；载体构建 　　Smad5是参与转化生长因子-β信号下游的细胞质内信号转导分子Smad家族成员之一，在哺乳动物已经分离鉴定的Smad蛋白有8种，Smad蛋白最早是通过基因筛查在无脊椎动物中分离出来的，它主要作用于丝氨酸/苏氨酸激酶受体下游。Smad蛋白分子量为（40-60）kd，其一级结构分为3个功能区，高度保守的N区和C区，以及序列长度不一的中间连接区（L）。骨形成蛋白是属于转化生长因子（TGF―β） 超家族，是一种在细胞生长、分化、凋亡和机体多种组织和器官形态发生中起重要调控作用的细胞因子。BMPs在牙胚的发生、成牙本质细胞的分化、第3期牙本质的形成中均发挥重要的作用[1，2]。本实验室重点研究TGF―β在牙釉质发育过程中的作用，Smad5作为BMPs的特异细胞内信号转导分子[3，4]，值得我们去探讨。本研究通过基因克隆及基因重组技术构建了Smad5的真核表达载体，为进一步研究TGF-β/Smad5与牙釉质发育相关基因的调控，表达奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　小鼠成釉细胞系（ALC）， RT-PCR试剂盒， RNAiso Plus，为Takara公司产品。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒为上海生工公司产品。真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA及E.coli BL21（DE3）由本实验室保存， DNA marker、KnpⅠ，XbaⅠ 和T4 DNA连接酶均为Promega公司产品。试验中所用引物合成与产物测序均在大连Takara公司完成。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1小鼠成釉细胞的培养 　　本实验室所用的成釉细胞系为日本Akita大学Sugiyama教授馈赠，在DMEM培养基（含100 g/L FBS），37℃，50 mL/L CO2 条件下进行培养。 　　1.2.2小鼠Smad5的克隆 　　1.2.2.1小鼠成釉细胞总RNA的提取以及cDNA的合成 　　小鼠成釉细胞系（ALC）复苏后，细胞传至3代以上用于实验。当细胞长满瓶底约80%-90%时，使用RNAiso Plus试剂按照说明书提取小鼠成釉细胞总RNA。参考反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 的要求进行反转录，在20μl体系中加入5μl的总RNA，1μl oligo（dt）18primer，6μl RNase-Free水，70℃温育10min后立即冰上冷却，在加入1μl Rnase Inhibitor，2μl dNTPmixture，4μl 5*Reaction Buffer ，混合均匀后37℃保温5min ，再加入1μl M-MuLV Reveerse Transcriptase，42℃温育60min 。70℃10min灭活逆转录酶，冰上冷却。获得用以进行RT-PCR的cDNA模板。 　　1.2.2.2 Smad5引物设计，合成以及PCR扩增 　　根据引物设计原则，利用软件Primer primer 5.0和Oligo 6进行引物设计。上游引物P1为：5′-TATA-GGTACC-ATGACGTCAATGGCCAG -3′，含KnpⅠ的酶切位点；下游引物P2为：5′- GCCCG-TCTAGA-TTATGAAACAGAAGATATGG -3′，含XbaⅠ的酶切位点。扩增条件94℃ 4 min，92℃ 30 s，62 ℃ 40s， 72℃ 3min，35个循环后72℃延伸5 min。 　　1.2.2.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳及其回收纯化 　　PCR反应结束后，取10μl反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照。按照DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的割胶回收。 　　1.2.2.4目的片段与pMD18-T Simple Vector连接反应 　　将割胶回收纯化的Smad5目的基因片段与pMD18-T Si