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《工业发酵的生物学原理》作业 参考论文：《调控光滑球拟酵母碳代谢流促 进? -酮戊二酸过量积累》 （毕业论文） 论文作者：张旦旦 PPT作者：杨钰（发酵工程2班， 学号 090201054） 实验目的： 以一株能在胞外大量积累丙酮酸和?-酮戊二酸的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)四重维生素的营养缺陷型菌株CCTCC M202019为出发菌株，结合生化工程和基因工程手段，调控碳代谢流进入TCA循环，同时阻断?-酮戊二酸的进一步代谢途径，使碳代谢流从过量积累丙酮酸转向过量积累?-酮戊二酸，提高?-酮戊二酸对丙酮酸的碳摩尔比。 总体来讲，要实现α-KG高产量必须满足以下两个条件： 将更多的碳代谢流通过PDH途径导入TCA循环； (2) 阻断碳代谢流通过α-KGDH途径的进一步代谢。 实验主要内容： (1) 以四重维生素缺陷型菌株T. glabrata CCTCC M202019为研究菌株，通过添加?-KG脱氢酶抑制剂，降低其活性，同时增加维生素B1浓度，提高PDH途径流量，将碳代谢流导入TCA循环。 (2) 以T. glabrata CCTCC M202019为出发菌株，通过基因工程手段，敲除编码?-KGDH-E1酶的基因kgd1，构建?-KGDH活性缺失的重组菌，比较研究重组菌和出发菌株在积累?-KG过程中的代谢参数变化，以及能量代谢、碳源代谢和氨基酸代谢的变化，明确?-KGDH在细胞代谢过程中的作用和地位。 (3) 以T. glabrata CCTCC M202019为出发菌株，通过基因工程手段，过量表达编码PDH-E1?亚基的基因pda1，构建高PDH活性菌株，研究PDH在发酵生产?-KG过程中的作用，并进一步推断PDH活性对积累TCA循环中间代谢产物的影响。 实验步骤：（略） 一、抑制α-KGDH活性 促进α-酮戊二酸过量积累 二、敲除α-KGDH-E1基因kgd1对细胞代谢及产酸的影响 (1) 利用酶切连接技术，在体外成功构建了敲除质粒pMD-kgd1::kan，并以该质粒为模板PCR得到敲除组件Kgd1::Kan，转化光滑球拟酵母，筛选得到重组菌T. glabrata kgd1::kan； (2) 重组菌α-KGDH活性缺失，ICL活性增加了70.7%，说明在α-KGDH途径受阻的情况下，细胞选择了增加乙醛酸途径流量来完成碳源的代谢，形成了TCA-乙醛酸循环； (3) 丙酮酸族氨基酸 ↓ 29.3% 谷氨酸族氨基酸 ↑ 34.7% 天冬氨酸族氨基酸 ↑ 26.8%； (5) 对重组菌T. glabrata kgd1::kan的发酵特性研究发现，敲除kgd1基因阻断α-KGDH途径，同时增加培养基中维生素B1浓度提高PDH途径流量，在一定程度上促进了丙酮酸的降解和α-KG的积累，使α-KG产量达到22.0 g/L，为对照的133.4%，同时CKG/CPYR值达到1.14，比出发菌提高了1.11倍。 三、过量表达pda1提高PDH途径通量促进α-酮戊二酸积累 (1) 利用酶切连接技术，将来自S. cerevisiae的pda1基因插入穿梭质粒pYX212的多克隆位点，在体外成功构建了表达质粒pYX-PDA1，其酶切和测序结果均与预期结果一致； (2) 将表达质粒pYX-PDA1转化T. glabrata △ura3感受态细胞，利用遗传互补原理，成功的在MM培养基上筛选得到了一株过量表达PDH活性的光滑球拟酵母T. glabrata-pda1，其胞内PDH表达活性达到0.35 U/mg protein，为出发菌的3.8倍； (3) 比较重组菌与出发菌的发酵过程曲线发现，过量表达pda1基因提高PDH途径通量，可有效促进丙酮酸的进一步代谢，并将碳代谢流导向TCA循环，使丙酮酸残留量降为10.4 g/L，而α-KG产量达到31.7 g/L，比出发菌(22.8 g/L)提高38.9%，同时CKG/CPYR值升高至3.05，这将有利于降低后续提取分离工序的成本，促进发酵法生产α-KG的工业化。 * 实验结果与讨论：（3方面） 1.63 (+217.3%) 1