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二是利用一级反应，本法的基本要求是作为某一工具酶底物的待测物的浓度[S]必须远小于该工具酶的Km。此时反应速度基本上与[S]成正比，呈一级反应。 动力学法较终点法具有简便、省时、干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对照以及易于自动化等优点，成为自动化分析的主要方法。但此法必须同时测定标准样品的反应速度，来推算未知样品中待测物的浓度。 2．酶活性测定的酶法分析 这类酶学分析法是用工具酶来测定待测酶的产物以求取待测酶的活性，适合于待测酶产物不能直接监测的情况。 也可有终点法和动力学法两种。 （1）终点法 将底物与待测酶反应一定时间后，终止反应，再用指示酶测定该时间内产物的生成量即可算出酶活性。 （2）偶联反应的基本动力学 S Ex P1 Ei P2 应先将样品与工具酶预保温，使样品中的内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物S起动反应。 起动后，因P从零开始升高，故工具酶反应速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这一时期称为延滞期。 随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶用量足够，就能正确地反映酶的活性. A 延迟期 恒态期 非恒态期 1.5 1.0 S Ex P1 Ei P2 0.5 0 30 60 90 120 150 180 秒 （以NADH减少为指示反应） 如Ei用量过少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的速度大于P1消失的速度，可导致P1的逐渐堆积，不能成为恒态或其延滞期极长。但如Ei用量足够，Vi等于或大于Vx，则P1一旦生成可较快或很快转变成P2，P1产生与消失速度一致而成为恒态。 （四）酶活性浓度的计算 Vt×106 U/L＝（△A/min）× Vs×L×ε △A 吸光度变化 Vt为反应系统总体积 Vs为样品体积 ε为被测物的摩尔吸光系数(mol-1 cm-1) L为光径 106是将mol转化成μmol。 酶反应时间曲线 时间(min) 5(t0) 反应时间越短， 10(t1) 线性范围越大 15(t2) 20(t3) 0 10 20 30 40 酶量[E] 米氏方程 E + S ES E + P k k k k +1 +2 -2 -1 v = V[S] Km+[S] v ＝ V 2 [S]　＝ Km 米氏曲线 [S] V Vmax Km Vmax 　 2 Km Km 米氏常数 米-孟氏公式：v＝Vm[S]/(Km＋[S]) 当[S]Km时，v＝(Vm/Km)[S]＝k[S]，呈一级反应。 当[S]Km时，则v＝Vm，即反应速度是一个常数，为零级反应。 如[S]～Km时，混合级反应。 米氏常数的意义 如v＝0.5Vm，则Km＝[S]，Km值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。 Km等于ES的解离常数；而Km的倒数可代表酶和底物的亲和力。 Km是酶的特征性常数，当pH、温度和离子强度恒定时，Km只和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。 纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则Km的变化不大。 米氏常数的应用 （1）如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时的v/Vm。 （2）如要求v占Vm一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km的多少