cDNA文库构建0.pptVIP

cDNA文库的构建 主要内容 基因文库的概念及意义 cDNA基因文库的类型 几种cDNA文库的介绍 SMART技术构建全长cDNA文库 一、基因文库的概念及意义 基因文库与基因库（gene bank） 区别 基因文库与基因克隆 构建基因文库的意义 根据基因类型（重组DNA片段的供体） 基因组文库和cDNA文库 1、基因组文库 cDNA文库优点 注意 3、 cDNA文库和基因组文库的区别 亚克隆文库 二、 cDNA基因文库的类型 依据起始mRNA是否经过标准化预处理 ：非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库 文库功能：克隆文库和表达文库 载体类型：质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体文库 根据文库构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为普通cDNA文库和全长cDNA文库 依据第一链反转录引物不同分为随机引物cDNA文库和Oligo d (T) cDNA文库 （一）非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库 （二）根据文库的功能分：克隆文库和表达文库 （三）不同载体文库 构建文库的载体 1.λ噬菌体载体 基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。 置换载体—Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“ 填充片段”gam和red基因座丢失引起的。 供体DNA的大小： 插入载体：0-10kbp; 置换载体：9-23kbp。 插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105％所限制。 主要应用： 插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。 置换载体:基因组DNA克隆。 2. 粘粒(cosmid)载体 基础：包含λ噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 载体筛选：类似于质粒 重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选； 供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105％所限制。 主要应用：基因组文库构建。 3.质粒载体构建cDNA文库 4.大容量克隆载体 (1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。 (2) P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs) 基础：噬菌体P1 导入宿主：体外包装和转导 载体筛选：显性选择标记 重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选 供体DNA大小：约100kbp 主要应用：大基因组分析 评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。 (3)酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YACs) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复) 重组筛选：插入片段大小 供体DNA大小：2000kbp 主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠 评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。 随机引物cDNA文库和Oligo d (T) cDNA文库 三、几种cDNA文库的介绍 经典 cDNA 文库 全长cDNA文库 均一化 cDNA 文库 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library) 全长差减均一化cDNA文库 固相 cDNA 文库构建 （一）经典 cDNA 文库构建的基本原理 1、高质量mRNA的制备 经典 cDNA 文库优缺点 （二）全长cDNA 文库构建的原理 反转录引物和反转录酶 5’端帽子结构 Oligo-capping CAPture法 SMART法 CAP-Trapper法 Capselect法 （三）均一化 cDNA 文库 优点 （四）差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library) 抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH) 原理 SSH是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。其运用杂交动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同