免疫分析法_1ppt课件.pptVIP

一、放射免疫分析法（RIA） 放射免疫分析中最常采用的标记物是125I和3H。125I衰变时放出β射线，3H衰变时放出γ射线，这些射线都很容易用仪器探测出来，而且灵敏度很高。 放射免疫分析试验最关键的地方是分离Ag*-Ab复合物和未结合的Ag*，以便进行定量检测。（参阅生化分离工程） 二、荧光免疫分析法（FIA），测定抗原 原理：在一定的可反应浓度范围内，待测抗原Ag的含量与反应之后形成的Ag-Ab复合物的含量成正相关。如果Ag-Ab复合物的含量可通过某种方便的手段测定出来，则就可以获得待测抗原Ag的含量。 一个分子发生荧光是由于它吸收了一定波长的光后，为了消散这部分吸收的能量而发射出波长较长的光。用紫外光照射蛋白质，可诱导蛋白质产生荧光，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基均能有效地产生荧光，其中色氨酸残基是产生荧光的主要成分，用波长为280nm的光照射提纯的抗体，它发射出的荧光波长为330-350nm。 1、荧光淬灭法 若这种激发的能量转移到不发生荧光的分子上，则蛋白质的荧光便减少，因此，当提纯的抗体与不具有荧光性质的半抗原作用时，由于紫外光照射所产生的激发能量被转移到不发生荧光的结合半抗原上，并为非荧光过程所消散，从而导致了抗体荧光的减弱或淬灭。 如果待测抗原Ag的含量越高，则与抗体作用后形成的Ag-Ab复合物就越多，荧光的减弱就越厉害。他们之间存在着一定的对应关系，该函数关系可以通过标准曲线获得。 由于该方法是通过测定抗体的荧光强弱变化，所以该抗体必须很纯（只能和待测抗原反应），这是他的缺点。 2、荧光增强法 某些半抗原和抗体结合，虽可导致蛋白质荧光的减弱，但这些从蛋白质色氨酸转移过来的激发能，并不被消散，而是被荧光半抗原吸收了，从而显示了半抗原的荧光增加（半抗原的荧光波长与抗体的荧光波长有一定的差异），这种现象被称为荧光增强。 这样，如果待测抗原Ag的含量越高，则与抗体作用后形成的Ag-Ab复合物就越多，半抗原的荧光波长处荧光的增强就越厉害。他们之间存在着一定的对应关系，该函数关系也是通过标准曲线获得。 该方法的明显优点是不需要提纯的抗体，因为测量的是半抗原荧光性质而不是抗体的荧光性质。 3、克隆酶给予体免疫分析法 ,CEDIA 利用重组DNA技术，合成酶的两个独立存在时无酶活性的蛋白质片段，但两者结合时则显示出酶活性的原理，作为分析方法的基础。 较小的片段（70-90氨基酸）被称为酶给予体片段（Enzyme donor，ED）； 另一片段约占整个酶氨基酸序列的97%，被称为酶受体片段（Enzyme accepter，EA） 。 ED标记的半抗原仍然具有抗原特异性； ED标记的半抗原与抗体结合后不能再与EA结合； ED标记的半抗原与EA结合后获得酶活。 当样品中待测半抗原增加时，使游离的ED标记半抗原增多，从而使组成的活性酶量增多，加入底物显色测定时则可显示出更强的反应。是现在最为灵敏的均相免疫分析法之一 。 第四节 非均相（液-固）免疫分析法 固-液免疫分析体系利用各种理化方法，实现抗原或抗体与不溶性介质如聚苯乙烯微孔板、各类凝胶载体、膜的连接，并利用高灵敏的检测手段来测定抗原-抗体的反应， 进而实现对抗体或抗原的分析。 目前，较成熟的固-液免疫分析体系包括酶联免疫分析法、免疫亲和色谱法等，我们主要给大家介绍酶联免疫分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。 1、ELISA基本原理 三点条件： 抗原或抗体能吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； 抗原或抗体可与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色变化来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成比例的 。 ELISA流程与原理： 1）在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应； 2）用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开； 3）再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例； 4）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色的深浅进行定性或定量分析； 5）由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 2、双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质； 2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固