慢性阻塞性肺疾病患者cd4t淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化状态及其意义-methylation status and significance of cd4t lymphocyte perforin gene promoter region in patients with chronic obstructive pulmonary disease.docxVIP

贵阳医学院硕士学位论文中文摘要慢性阻塞性肺疾病患者CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化状态及其意义研究生：廖强导师：张湘燕、张程摘要目的：1、研究慢性阻塞性肺疾病患者外周血CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化状态;2、探讨CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化状态在慢性阻塞性肺疾病发病机制中的作用。方法：1、分离6例慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者及6例正常对照者外周血CD4+T淋巴细胞，提取DNA。2、采用亚硫酸钠测序法，对6例慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者及6例正常对照组外周血CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平进行检测。结果：（1）慢性阻塞性肺疾病患者CD4+T淋巴细胞穿孔素基因的启动子区域甲基化水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P0.05)。结论：（1）在CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域，慢性阻塞性肺疾病患者平均甲基化水平低于正常对照组。(2)慢性阻塞性肺疾病患者CD4+T淋巴细胞穿孔素基因的启动子区域低甲基化状态在COPD发病中起了重要的作用。关键词：自身免疫性肺气肿，DNA甲基化，穿孔素基因3前言慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructivepulmonarydisease．COPD）是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，其气流受限多呈进行性发展，与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或有害颗粒的慢性炎症反应增强有关。据GOLD（2013）指南，到2020年COPD将成为全球第三大致死病因。在我国，COPD在40岁以上人群发病率约8.2%，其发病率、病死率高，严重危害了人们健康。COPD的发病机制尚未完全明了。吸入有害颗粒或气体可引起肺内氧化应激、蛋白酶和抗蛋白酶失衡以及肺部炎症反应等不同途径而导致血管内皮细胞凋亡从而引起肺泡损害以及肺气肿形成。但相关研究发现，许多COPD患者在戒烟以后，肺泡损害及气道炎症仍然持续存在，甚至逐渐加重[1]，所以从经典的三大学说来解释COPD的发病机制是不够全面的。近来的研究发现，COPD的发病与自身免疫密切相关。相关研究表明，在慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发生及发展中，CD4+T细胞介导的自身免疫反应起了重要的作用。有人在COPD吸烟者肺实质和气道中发现了大量CD4+T细胞[2]。国外有研究发现，将脐带内皮细胞注入正常大鼠的腹腔中，可引起肺内CD4+T淋巴细胞增多，血清中可以检出抗血管内皮细胞抗体，可引起肺泡隔细胞凋亡，最终导致自身免疫性肺气肿，从自身免疫性肺气肿大鼠的脾脏中提取CD4+T淋巴细胞，再将提取的细胞注入到另一正常组大鼠腹腔中，结果发现也可以导致该大鼠形成肺气肿[3]。人们早已发现，T淋巴细胞自身活性的调控与其DNA甲基化程度相关。根据表观遗传学相关理论，通常DNA甲基化与基因处于抑制和失活状态相关，DNA的低甲基化状态与基因的活化有关[4]，所以用DNA甲基化抑制剂（如：5-氮杂胞苷）处理的T淋巴细胞，其细胞活性明显增强，甚至可能引起某些自身免疫性疾病[5-8]。说明T细胞DNA低甲基化状态可能和自身免疫性疾病的发生有关。穿孔素(perforin,属于成孔蛋白pore-formingprotein,PFP)是一种分子量为67kD,存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞胞质的细胞毒颗粒中的糖蛋白。当与靶细胞密切接触相互作用后，细胞可释放穿孔素。穿孔素的作用是在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏。穿孔素不仅是重要的效应分子，而且是重要的免疫调节分子，在自身免疫中起着重要的作用。T淋巴细胞的活性增加，可引起穿孔素基因表达，引起一些自身免疫性疾病，如活动期SLE患者的CD4+T细胞穿孔素基因启动子区域低甲基化状态引起穿孔素基因活性增加，继而引起穿孔素表达增多，在SLE的发病过程起着重要的作用[9，10]。国外有学者研究发现[13]：COPD患者穿孔素的表达较正常对照组增强明显，所以我们可以推测穿孔素可以透过引起自身免疫反应在COPD的发病中起了扮演重要的角色。终上所述：CD4+T淋巴细胞穿孔素基因的启动子区域处于低甲基化状态，可引起穿孔素的过度表达从而导致肺泡隔细胞死亡，最终导致肺气肿的形成。我们拟通过对COPD患者的CD4+T淋巴细胞穿孔素启动子调控区域甲基化状态进行研究，以期为完善肺气肿的发病机制及寻求一可能的治疗途径奠定基础。1材料与方法1.1主要实验试剂（1）人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司）（2）人CD4+T淋巴细胞分选磁珠（德国美天妮公司）（3）亚硫酸氢盐处理试剂盒（德国QIAGEN公司）（4）基因组和RNA分提试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）（5）DNAmarker(宝生物大连有限公司)（6）大量琼脂糖胶回收试剂盒（北京天根生物有限公司）（7）2×Powe