马铃薯病毒多重rt-pcr检测技术研究-study on multiple rt - pcr detection technology of potato virus.docxVIP

摘要摘要马铃薯是世界性高产作物，我国种植面积和产量都居世界第一位。马铃薯病毒病是马铃薯生产中的重要制约因素，大规模组织培养无病毒种薯生产是控制马铃薯病毒病的主要方法，而优良种薯生产要求建立快速，准确，灵敏的病毒检测方法。本研究的主要目的是开发适合于同步检测多种马铃薯病毒的多重反转录聚合酶链式反应(M-R1工，PCR)检测体系，为研制马铃薯病害多靶标、固相化检测试剂盒，提供技术保障和测试手段。1.lU.P侃反应引物的设计z根据已知马铃薯病毒外壳蛋白区序列设计马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)及马铃薯S病毒(PVS)特异性引物对:根据Pl基因区序列设计马铃薯A病毒(PVA)特异性引物对:根据全基因组序列设计马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)特异性引物对.采用一步法和两步法KI-PCR对5种病毒和类病毒进行了同步扩增，扩增片段大小为562bp(PVX)、物Obp(PVY)、336bp(PLRV)、255bp(PVA)、182bp(PVS)、360bpσSTVd).2.简易快速的样品制备技术的建立z配制的以O.5%1ìiωnX-l∞R和0.4%NazSO;J为主要成分的马铃薯病毒阳A浸提液，可以从叶片、叶梗、茎干、马铃薯薯块中快速释放马铃薯病毒RNAo浸提法提取马铃薯病毒RNA快速简单，只需将叶片(5mglOmg)，叶梗或茎干(2伽1ng3伽19)，马铃薯块。伽19ωmg)加入1∞μ1病毒浸提液中子37C恒温水浴2伽曲，离心后将上消液直接用来进行盯pα反应.测试表明，病毒ssRNA上消液于-20至少可以保存3个月，可用于单室，多重盯PCR反应。简易浸提法操作简单、快捷有效，样品完全适合反转录合成cDN以供PCR扩增。3.两步法RT.PCR检测体系优化=优化了两步法单蠢，二重和多重阳PCR反应，利用优化的多重RT.PCR反应体系可以同步检测马铃薯多种病毒。优化的单重lU-Pα反应中，反转录反应总体积为10μU管，需2.5URNA酶抑制剂(Promega)f25UMMLV反转录酶(MMLVRT，Promega)，制1sPO.5mmol/L，42.C反转录3仇nin.PCR反应总体和、为25时，O.2mmo1/L创TPs，lU重组Taq酶(promega)，2.5mmolJLMgC12，PCR反应条件是94.C变性308，ω℃退火30s，72C延伸30s，共30个循环，末次延伸72C1伽nin。二重RT-PCR反转录反应中dNTPs1.0mmol/L，其他试剂浓度与单重RT-PCR相同。多重阳工PCR反转录反应中创TPs增加至1.5mmol凡，RNA酶抑制剂增加至10U，反转录酶增加至100U。多重RT-PCR聚合酶链式反应中dNTPs增加至O.5mmo况，2U重组Taq酶，3.5mmol/LMgCho反转录反应程序中42.C反转录45m忌，PCR反应程序中72C延伸1min，其它条件与单重RτPCR反应相同。4.双雷每一步法检测试剂配方优化:试验中配制了适用于反转录和PCR反应的一步法RT-PCR反应缓狞液，优化了一步法反应条件，利用优化的反应条件可以同步检测马铃薯多种病毒。优化的一步法单重RT-PCR反应中加入1.5mmol/LMgCh，5U刚A酶抑制剂，50UMMLV1西南农业大学硕士学位论文反转录酶.1U重组Taq酶，0.5mmollLdNTPs，病毒下游引物0.51.1mo沉I二重加入2.5mmol几MgC12，1.伽nmol几dNTPs;多重KT-PCR反应中加入3.5mmoVLMgCh，10URNA酶抑制剂，1∞UMMLV反转录酶，1.5mmol几创τPSo单重和二重反应条件为25灿nin，420C3仇nin，950C2min;94C3缸，60.C30s，72C3OS，共30个循环，最后729C10min多重反应条件为25C10min，420C45min，952min;9430s，60C30s，72C1min，共30个循环，最后720C10min。扩增产物的准确性验证z切胶回收PVY、PVX、PVA、PVS、PLRVKT-PCR扩增产物，分别克隆到pl\ID18-T载体中，通过PCR验证得到的阳性克隆〈白色菌落〉分别含有以上5种病毒的靶序列cDNA;提取质粒测序，经用NCBIBIAST比对，结果表明扩增的5种马铃薯病毒靶带的序列与己知基因的靶序列完全一致，表明RT-PCR扩增产物准确无误。6.Rf.PCR检测性能测定z采用马铃薯5种病毒的引物对经RT-PCR扩增天空葵皱缩花叶病毒，南瓜花叶病毒，番茄花叶病毒，蜀葵花叶病毒的RNA，不产生任何DNA条带，而阳性对照有特异性靶带，阴性对照无任何DNA条带产生。紫外分光光度计测定蛋白酶K法提取的PVX病毒总RNA含量为56ωngf时，稀释104