慢病毒介导的siscn9a下调nav1.7的表达在神经病理痛中的镇痛作用-the analgesic effect of slow virus mediated sis cn9a down-regulating nav 1.7 expression in neuropathic pain.docxVIP
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慢病毒介导的siscn9a下调nav1.7的表达在神经病理痛中的镇痛作用-the analgesic effect of slow virus mediated sis cn9a down-regulating nav 1.7 expression in neuropathic pain
原创性声明郑重声明:本人所呈交的学位论文,是在导师的指导下,进行独立的研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者:日期:年月日学位论文使用授权声明本人在导师的指导下完成论文及相关作品,知识产权归属于郑州大学。根据郑州大学有关保留和使用学位论文的相关规定,本人同意学校保留或向国家相关部门或机构送交论文电子版和复印件,允许论文被查阅、借阅;本人授权郑州大学可以将本学位论文的部分或全部编入相关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者:日期:年月日慢病毒介导的siSCN9A下调Nav1.7的表达在神经病理痛中的镇痛作用研究生:李攀阳导师:臧卫东教授曹靖副教授专业:人体解剖学系河南郑州450001摘要背景与目的神经系统原发性损害或功能障碍所引起的异常痛觉、自发性疼痛、痛觉过敏的现象,称为神经病理痛。神经病理痛患病率高,患者生存质量差,治疗效果不满意。至今神经病理痛的发生机制尚不完全清楚,机械损伤、神经的代谢或营养性改变、病毒感染或放疗的神经毒性、缺血性神经损害、神经递质功能障碍均可导致神经病理痛。目前,疼痛的治疗方法主要是通过局麻药、抗抑郁药、中枢性抑制药、抗癫痫药等,疗效短暂、副作用大,且易产生药物依赖。近期的研究表明,电压门控钠离子通道Ⅸα亚基(Nav1.7,SCN9A编码)可能与三种痛觉异常性疾病即肢端红痛症、阵发性剧痛症、先天性无痛症密切相关。其中Nav1.7功能错义突变引起肢斑红痛症和阵发性剧痛症,Nav1.7无义突变引起先天性无痛症。电压门控钠离子通道Nav1.7主要表达在DRG和交感神经节中。DRG中表达各种各样的钠、钾离子通道。这些离子通道包括转换、传导神经信号、调节突触的运输三大功能。神经受伤后,受损或者未受损的神经元均会出现异常的放电活动,这种异常放电是否是Nav1.7的异常表达所引起的?因此,我们设计以下实验,并希望通过对Nav1.7表达的干预来治疗神经病理痛提供实验数据。本研究通过建立SNL神经病理痛模型和原代培养DRG神经元细胞,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激神经元细胞;构建慢病毒,体内、外实验两个方面感I染慢病毒介导的siSCN9A(LV-siSCN9A),观察行为学及钠离子通道Nav1.7的变化,阐明Nav1.7在神经病理性疼痛中的作用,为神经病理性疼痛的转基因治疗提供重要的理论和实验基础。方法1.构建慢病毒介导的siSCN9A,培养PC12,感染慢病毒后并进行滴度测定。2.用TNF-α刺激体外培养出生21d的SD大鼠DRG神经元细胞,通过免疫组化及Western-blot检测Nav1.7的表达情况。慢病毒介导的siSCN9A分别感染有和无TNF-α刺激的神经元细胞,Western-blot检测各个组别中Nav1.7的表达情况,免疫荧光检测慢病毒的感染效率。3.制作SNL神经病理痛模型,行为学检测术前1d,术后3,7,10,14,21d大鼠机械痛阈值和热缩足阈值的变化,免疫荧光双标和Western-blot检测各组中术后7d时Nav1.7的变化,统计Nav1.7的灰度值。4.DRG微量注射2μl的LV-siSCN9A和LV-SC。行为学检测机械痛阈值和热缩足阈值,免疫荧光双标和Western-blot检测各组中Nav1.7的变化,并统计Nav1.7的灰度值。免疫荧光检测大鼠脊髓背角中CGRP的表达情况,并统计CGRP的荧光强度。结果.构建的慢病毒介导的siRNA的基因测序为ACAGCATGATCTGCTTGTTCC与目标基因SCN9A的CDS区的5084-5104碱基序列完全配对,慢病毒介导的siRNA感染培养的PC12细胞选用的MOI=10可以满足我们的实验需要。检测慢病毒的滴度为6×108。.体外原代培养的神经细胞用100ng/mlTNF-α刺激Westernblot结果显示与对照组相比,TNF-α组的Nav1.7蛋白表达增加,?x±s分别为(0.78±0.07、0.34±0.04);p=0.013;免疫荧光显示病毒携带的GFP在神经细胞内表达,LV-siSCN9A感染神经元细胞后感染效率达到80%左右。与LV-sc组相比,LV-siSCN9A感染原代培养的神经元后可以抑制TNF-α刺激引起的Nav1.7的高表达?x±s分别为(0.26±0.05、0.73±0.08);p=0.02。3.制作SNL神经病理痛模型,与Sham组相比,SNL组大鼠术侧的痛敏阈值(13
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