胚乳特异性alp type-b基因启动子的克隆及其功能分析-cloning and functional analysis of endosperm-specific alp type - b gene promoter.docx

ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyinBiochemistryandMolecularBiologyCloningandFunctionalAnalysisofanEndspermSpecificPromoterofALPType-BGenePh.DCandidate：SongFeiMajor：BiochemistryandMolecularBiologySupervisors：GuangyuanHeHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan,Hubei430074,P.R.ChinaAugust,2012独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日摘要胚乳特异性启动子的克隆和功能分析不仅有助于阐明作物种子发育和胚乳特异性基因的表达调控机制，同时也是进行包括作物品质改良和作物种子反应器在内的植物基因工程改造的基础。小麦avenin-like储藏蛋白基因(avenin-likestorageproteinsgene，ALPgene)是近年来发现的一种新型储藏蛋白基因，因其编码的蛋白质序列与燕麦储藏蛋白Avenin的相似性最高，故称类燕麦储藏蛋白。类燕麦储藏蛋白有ALPtype-A和ALPtype-B两种亚型。与其他储藏蛋白相比，ALP蛋白的显著特点是具有更多的半胱氨酸残基。其中ALPtype-A含有14个半胱氨酸残基。ALPtype-B蛋白至少含有18个半胱氨酸残基，推测其可能形成分子内或分子间二硫键，从而改变储藏蛋白的空间结构和构型，进而对小麦面粉的加工品质产生重要影响。实验室前期采用RT-PCR分析发现，ALPtype-B基因只在小麦胚乳中表达，在根、茎、叶和花等其它组织中则没有表达，表明ALPtype-B基因的表达类型具有胚乳特异性，故推测小麦ALPtype-B基因启动子是一个胚乳特异性启动子。为深入研究小麦ALPtype-B基因的调控机理及胚乳表达特性，本研究对小麦ALPtype-B基因的上游启动子序列进行了克隆及功能分析，主要研究内容和结果如下：（1）根据已知的小麦ALPtype-B基因序列，采用Inverse-PCR技术，从小麦品种鄂恩1号（En1）中克隆得到了ALPtype-B基因的上游启动子序列1,664bp。通过PLACE和plantCARE等数据库对所克隆的启动子序列进行生物信息学分析，发现该启动子除具备启动子的基本元件如TATA-box、CAAT-box等外，还含有胚乳特异性表达的特有元件如Prolamin-box、GCN4-likemoti（fGLM）、ESP-likeelement、RYmotif和G-box等。其中位于-677bp(以ATG为+1计)的ESP-likeelement与其上游RYmotif的核心序列CATG重叠。（2）为了验证所克隆得到的小麦ALPtype-B基因启动子的表达特性和深入分析其序列上各顺式作用元件的作用，基于对顺式作用元件序列的生物信息学分析和文献报道，以pBI121为框架载体构建了包括ALPtype-B基因上游1,664bp序列及四个分别含有不同序列长度的5端缺失启动子999bp、785bp、550bp和290bp在内的I五个双元表达载体，并以其长度为基础命名为pALP-17、pALP-10、pALP-8、pALP-6和pALP-3。在这五个双元表达载体中，质粒pALP-3的构建是为了验证prolamin-box是否可以保持启动子的胚乳表达特异性；pALP-6的构建是为了验证位于-290bp处prolamin-box上游的其它endospermmotif和GLM是否对启动子的启动强度起到增强作用；pALP-8的构建则是因为含有与胚乳特异性上调元件ESP相似的ESP-like元件，这是继ESP元件在燕麦储藏蛋白启动子中被报道后首次在其他