水牛7sku6启动子克隆 活性分析及抗口蹄疫转基因小鼠模型建立-cloning activity analysis of buffalo 7 s ku6 promoter and establishment of transgenic mice model against foot-and-mouth disease.docx

水牛 7SK/U6 启动子克隆、活性分析及抗口蹄疫转基因小鼠模型建立 摘 要 水牛具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使 用年限长等优点，非常适合我国南方农村饲养，是我国南方极具开发价值 的大家畜。口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的以侵害偶蹄动物为主的急性、 热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为 A 类动物传染病。为 应用水牛 RNA 聚合酶 III 启动子进行基因沉默研究，探讨应用 RNAi 沉默 水牛口蹄疫病毒的可行性，本研究对水牛的 7SK 和 U6 启动子进行了克隆 与活性分析，并应用其构建了多启动子串联 RNAi 抗口蹄疫病毒转基因小鼠 模型，取得了如下的研究结果： 1、水牛 7SK 和 U6 启动子克隆与功能分析。参考牛的基因组序列，设 计特异性扩增引物，成功克隆了长 430 bp 和 357 bp 的水牛 7SK（Genbank 序列号：JN417658）和 U6 启动子（Genbank 序列号：JN417659）。为对比 不同物种 polIII 启动子的活性，本研究还克隆了人、猪和牛的 7SK 和 U6 启动子。克隆的启动子与针对 EGFP 的短发卡 RNA（shRNA）双链 DNA 片段（shEGFP）相连接，成功构建 8 个 EGFP 沉默表达载体（pbu7SK-shEGFP、 pbuU6-shEGFP 、 ph7SK-shEGFP 、 phU6-shEGFP 、 pbo7SK-shEGFP 、 pboU6-shEGFP、pp7SK-shEGFP 和 ppU6-shEGFP）。将构建的载体转染水牛 胎儿成纤维细胞（BFF），转染后 72 小时通过茎-环 QRT-PCR 检测细胞 RNA 中的 shEGFP 相对表达量。结果显示，以 h7SK-shEGFP 组为 100%， bu7SK-shEGFP 和 buU6-shEGFP 组 中 的 shEGFP 含 量 高 达 257.17% I II II （±33.79%）和 174.67%（±32.94%），表明水牛 7SK 和 U6 启动子能启动 shEGFP 在细胞中高效表达。将构建的载体与 pEGFP-N1 共转染水牛和小鼠 细胞，转染后 60 h 在荧光显微镜下可观察到共转 shEGFP 表达载体的细胞 发生了明显的荧光表达沉默现象；转染后 72 h 的 BFF 流式细胞仪分析发现， 转入 pbu7SK-shEGFP 和 pbuU6-shEGFP 的细胞中沉默 EGFP 效果显著高于 其它各组，沉默效率高达 93.82% (± 0.16%)和 87.45% (±0.52%) (p0.05)。 QRT-PCR 的检测结果显示，pEGFP-N1 与 bu7SK-shEGFP 共转染水牛细胞 的 EGFP 表达水平（下降 93.29% ± 1.30%）和 buU6-shEGFP 共转染的 EGFP 表达水平（下降 93.45% ± 1.25%）差异不显著（p0.05），两者的 EGFP 表 达水平均显著低于其它物种启动子的共转染组（p0.05）。在小鼠细胞中， 共转染 bu7SK-shEGFP 的 EGFP 沉默效率最高（下降 91.29 ± 1.03%）。上述 结果表明，克隆得到的水牛 7SK、U6 启动子可以高效启动 shRNA 的表达， 进而产生沉默目的基因的 RNA。 2、多 shRNA 串联抗口蹄疫病毒 RNAi 载体的构建。首先针对口蹄疫病 毒 3B 和 3D 保守区域设计并化学合成三个 shRNA 串联片段，然后分别连接 水牛 7SK、水牛 U6 和牛 U6 启动子，构建成 bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6- Cons3 三个 shRNA 串联表达盒，并连接入慢病毒载体质粒 pSicoR 构建成抗 口蹄疫转基因载体 pSicoR-3shRNA （用 CMV 启动的 EGFP 作为标记基 因）。利用慢病毒三质粒包装系统 pNRF、pVSVg 和 pSicoR-3shRNA 共转于 293T 细胞包装成慢病毒颗粒，然后感染 BHK-21 细胞，获得转基因细胞， 通过茎环 RT-PCR 检测转基因细胞的针对口蹄疫病毒的三个 shRNA 表达。 为验证转基因细胞和慢病毒载体的口蹄疫病毒抗性，首先将 O 型口蹄疫病 III III 毒接种入表达抗口蹄疫 shRNA 的 BHK-21 转基因细胞中，观察比较接毒后 48 h 内转基因细胞中口蹄疫病毒复制情况，同时分别将滴度为 1000、100、 20 和 5 LD50 的 O 型 FMDV 毒株接种于抗口蹄疫慢病毒载体预处理过的 3~5 日龄乳鼠（LV），以接毒 PBS 预处理乳鼠作为对照（NC）。细胞抗性结果 显示，与普通细胞相比，转基因细胞在接种