芍药苷对6-ohda诱导的帕金森模型保护作用及其机制的分析-protective effect of paeoniflorin on 6 - ohda - induced parkinsons model and analysis of its mechanism.docxVIP

验药物治疗组损毁侧纹状体DA及代谢产物DOPAC、HVA含量显著升高，DA代谢产物与DA之比显著下降（##p0.01）。生理盐水组损毁侧纹状体5-HT及其代谢产物5-HIAA的含量与假手术组相比无明显差异，各实验药物治疗组与生理盐水组相比亦无明显差异。(5)PD大鼠的未损毁侧纹状体D1R、D2R以及DAT的受体mRNA的表达水平与假手术组无差异。生理盐水组损毁侧纹状体D1R、D2R以及DAT的受体mRNA的表达水平与假手术组相比下降明显（**p0.01）。与生理盐水组比较，各实验药物治疗组损毁侧纹状体D1R、D2R以及DAT的受体mRNA的表达水平明显升高（#p0.05，##p0.01）。结论：通过脑立体定位注射6-OHDA可成功建立PD模型，PF和酸通道阻滞剂对黑质多巴胺神经元损伤有明显保护作用，对纹状体多巴胺受体有一定调节作用。提示PF对黑质多巴胺神经元的保护与ASICs有关。关键词：PF；酸通道阻滞剂；多巴胺神经元；单胺类递质；多巴胺受体II第二部分：芍药苷对6-OHDA诱导的PC12细胞和中脑原代神经细胞损伤的的保护作用目的：建立6-OHDA诱导的的细胞损伤模型，研究芍药苷和酸通道阻滞剂能否改善6-OHDA对大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）和原代培养的中脑神经细胞的损伤。方法：体外培养PC12细胞和胎鼠的中脑神经细胞，预先加入无菌生理盐水、不同浓度PF（25，50，100uM）、PCTX1（2.5nM）和Ami（100uM）处理细胞1h，再加入6-OHDA（50uM）作用18h后，使用MTT法和LDH试剂盒测定各组细胞的存活率和损伤程度；免疫荧光技术观察中脑神经细胞内TH的表达，对DA能神经元纯度进行检测。结果：(1)与control组比较，生理盐水组PC12细胞和中脑神经细胞其存活率均明显下降（**p0.01），PC12细胞中下降约60%，中脑神经细胞中约50%，PF、PCTX1、Ami预处理组，存活率和生理盐水组比有显著上升（#p0.05，##p0.01），。(2)生理盐水组PC12细胞和中脑神经细胞LDH值较对照组均明显上升（**p0.01），PC12细胞中上升约69%，中脑神经细胞中约67%。与生理盐水组比，PF、AM、PCTX1预处理组，LDH值有显著下降（#p0.05，##p0.01）。(3)免疫荧光检测，原代培养的中脑神经细胞中DA能神经元纯度在7.56±1.23%。结论：PF和酸通道阻滞剂对6-OHDA诱导损伤的的PC12细胞和原代培养的神经细胞有明显保护作用，提示PF对多巴胺能神经细胞的保护与ASICs有关。关键词：PF；酸通道阻滞剂；PC12细胞；中脑神经细胞；MTT；LDHIII第三部分：芍药苷对ASIC1a介导的α-syuclein自噬降解的调控作用目的：研究PF和酸通道阻滞剂能否抑制敏感离子通道（Acid-sensingionchannels，ASICs），能否调控自噬并加速α-syuclein的降解。并探讨ASICs和自噬的关系，PF是否通过阻滞ASICs,尤其是ASIC1a来调控自噬发挥作用。方法：以6-OHDA诱导的PD大鼠和PC12细胞为研究对象，通过免疫荧光和免疫印迹技术检测检测黑质和PC12细胞α-synuclein、自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ、p62）以及ASIC1a的蛋白表达变化；通过膜片钳技术，检测PF是否能抑制酸处理后激发的电流。结果：(1)在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中，与假手术组比较，生理盐水组损毁侧黒质DA能神经元α-synuclein、LC－3II、p62和ASIC1a蛋白水平显著增加（**p0.01）。与生理盐水组比较，PF、PCTX1、Ami治疗组α-synuclein、LC－3II、P62、ASIC1a的蛋白水平均有不同程度下降（##p0.01）。(2)在6-OHDA诱导损伤的PC12细胞中，与control组比较，生理盐水组α-synuclein、LC－3II、p62和ASIC1a蛋白水平显著增加（**p0.01），PF、PCTX1、Ami预处理后均能不同程度下调α-synuclein、LC－3II、P62、ASIC1a的蛋白水平（##p0.01）。(3)而且类似于PCTX1和Ami的作用，PF也对酸诱导的电流有一定抑制作用，且呈浓度依赖效应。(4)免疫荧光也显示了6-OHDA损毁侧黒质DA能神经元和6-OHDA诱导损伤的PC12细胞上和TH共表达的ASIC1a表达增加。结论：6-OHDA作用后，出现ASICs激活，自噬活性过度上调，自噬功能障碍，细胞内α-syuclein聚集；PF和酸通道阻滞剂能够抑制酸诱导的电流,以及ASIC1a的表达；PF和酸通道阻滞剂均能改善自噬功能障碍，减缓自噬活性过度上调，促进α-syuclein的降解；抑制ASICs，尤其是ASI