嗜冷菌pseudomonas psychrophilaha-4降解水中磺胺甲基异恶唑的特性及机制研究-study on the characteristics and mechanism of degrading sulfamethoxazole in water by psychrophilus psychrophilia - 4.docx

ClassifiedIndex:X703U.D.C:628.35DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineeringCHARACTERISTICANDSULFAMETHOXAZOLEFROMAQUEOUSSOLUTIONDEGRADATIONMECHANISMOFPseudomonaspsychrophilaHA-4Candidate：JiangBenchaoSupervisor：Prof.MaFangAcademicDegreeAppliedfor：DoctorofEngineeringSpeciality：EnvironmentalScienceEngineeringandAffiliation：SchoolofMunici.Envir.Eng.DateofDefence：June,2014Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology摘要摘要磺胺甲基异恶唑（SMX）是一种含有氮杂环结构的抗生素，其具有不易被生物降解的特性，传统的污水处理工艺很难将其有效去除。近年来，随着该药物使用量的增加，其在地表水体中被频繁检出，已成为一种新兴的污染物。低温往往会影响该物质的去除，目前，提高其在低温环境中的去除率成为亟待解决的问题。为此，本研究利用微生物纯培养技术，筛选出一株能够高效降解磺胺甲基异恶唑的嗜冷菌株，并对其进行鉴定，考察其生物降解特性，推测磺胺甲基异恶唑的生物降解途径，并从基因水平探讨磺胺甲基异恶唑的生物降解机制。研究成果对具有高效降解磺胺甲基异恶唑能力的微生物菌剂的开发及环境中的磺胺甲基异恶唑污染的有效治理具有重要意义。本研究筛选出一株能以磺胺甲基异恶唑为唯一碳源生长的嗜冷菌HA-4。经鉴定菌株HA-4属于Pseudomonas菌属。菌株HA-4的最佳生长降解条件为：pH=6.0左右，温度范围为10oC-15oC，摇床转速为150r/min，接种量为15%（V/V），且在此条件下，192h磺胺甲基异恶唑的降解率为34.3%。菌株HA-4还能降解咔唑、卡马西平、苯胺、联苯胺等一些常见的PPCPs化合物及芳香族化合物。蛋白胨可有效促进菌株HA-4对磺胺甲基异恶唑的降解，其降解率增加量超过16%。当溶液中Ca2+、Fe3+、Al3+、Cd2+、Co2+、Cu2+和Zn2+的浓度达到1mmol/L时，菌株HA-4的降解能力会受到明显的抑制作用。在10°C时，菌株HA-4的不饱和脂肪酸及短链脂肪酸的含量百分比均为最高，分别为23.03%和3.58%，此为菌株的适冷策略之一。Haldane方程可以较好地拟合菌株HA-4以磺胺甲基异恶唑为底物的生长动力学性能，动力学参数-1?max=0.01h，Ks=20.91mg/L，Ki=170.60mg/L。磺胺甲基异恶唑被菌株HA-4降解后的产物，经GC-MS及HR-MS分析，鉴定为苯胺、3-氨基-5-甲基异恶唑、对巯基苯胺、对氨基苯磺酰胺及4-氨基-羟基苯磺酰胺。磺胺甲基异恶唑能被部分矿化，在此过程中，结构中的氮和硫分别以NH4+和SO42-的形式释放到溶液中。基于上述分析结果，推测出一条新的磺胺甲基异恶唑生物降解途径，即：磺胺甲基异恶唑首先在直链末端沿着两条路径被水解，经N-C键和S-N键断裂，分别形成4-氨基-羟基苯磺酰胺和3-氨基-5-甲基异恶唑，4-氨基-羟基苯磺酰胺不稳定，其中的C-S键断裂以及氨基基团脱离，形成苯胺，同时向溶液中释放出SO42-和NH4+，产物苯胺被继续降解及矿化，转化为CO2和H2O。利用第二代测序技术，对菌株HA-4进行了全基因组测序，通过RASTI-哈尔滨工业大学工学博士学位论文annotationserver对测序结果进行注释，结果表明：菌株的基因组大小为5,235,696bp，GC含量为56.4%；共有28类功能基因，得到155个与应激反应相关的基因，167个与脂肪酸、脂质和类异戊二烯代谢有关的基因，75个与芳香族化合物代谢有关的基因。基因组中含有6个基因编码冷休克蛋白，分别为cspA1、cspA2、cspA3、cspC、cspD及cspG，它们均属于cspA家族成员，其中前三个属于cspA类基因。推测该类基因的存在有助于菌株HA-4适应长期的寒冷环境。菌株HA-4可能因体内含有的S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶及通过基因序列注释找到的29个与抗生素抗性相关的基因而耐受一定浓度的磺胺甲基异恶唑，其中S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶可能参与磺胺甲基异恶唑的生物转化。对菌株HA-4中与磺胺甲基异恶唑降解相关的基因编码酶系进行分类汇总可得，在降解过程中，氧化还原酶为最关键的酶。运用生物信息学分析得出，磺胺甲基异恶唑的生物降解可能依次经水解酶、二苯并噻吩脱硫酶等酶催化