石楠拟盘多毛孢(pestalotiopsis photiniae)次级代谢产物dmmp抗肿瘤机理的初步研究-preliminary study on antitumor mechanism of secondary metabolite dmmp of pestalotiopsis photinia.docxVIP

摘要DMMP(4-(3,3-dimethylallyloxy)-5-methyl-6-methoxyphthalide)，是从石楠拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisphotiniae)次级代谢产物中分离得到的酚肽类化合物。利用MTT比色法计算其对细胞的半数抑制浓度(IC50)，结果得出DMMP对HeLa、MCF7、MDA-MB-231和MRC5的IC50分别为36、54、78和123μg/mL，对人宫颈癌HeLa细胞的抑制性最强，而人胚肺成纤维细胞MRC5对DMMP最不敏感。DMMP对HeLa不同时间的IC50分别为24h：36μg/mL、48h：22μg/mL、72h：13μg/mL。通过MTT法检测DMMP抗肿瘤活性可知DMMP作用细胞具有一定的细胞选择性，并且有时间依赖性和剂量依赖性。DAPI染色观察细胞核形态变化，发现细胞出现凋亡特征。JC-1染色结果显示DMMP可以诱导HeLa细胞线粒体膜电位发生变化。又通过流式细胞术检测了DMMP作用后的HeLa细胞的凋亡情况，发现DMMP可以促进细胞早期凋亡的发生，并且将HeLa细胞周期抑制在G1/S期。用Westernblot免疫印记法和实时荧光定量PCR检测线粒体通路相关蛋白发现截短型Caspase9、Caspase3和AIF蛋白均出现表达量升高的现象，因此可以证实DMMP通过线粒体凋亡途径使HeLa细胞发生凋亡。经研究发现可以抑制细胞周期G1/S期的p53蛋白和pRb蛋白相关信号通路中的蛋白、mRNA表达均发生变化，说明两条信号通路在周期抑制时均发生作用。值得注意的是DMMP抑制了人乳头瘤病毒蛋白原癌基因HPV18E6和HPV18E7的基因表达，而且这类基因表达的已经被确认为宫颈癌发生的主要原因，DMMP可以作为以人乳头瘤病毒蛋白为靶点的治疗宫颈癌的小分子化合物研究。总之，DMMP具有较好的研究价值和应用前景。关键词石楠拟盘多毛孢菌DMMP半数抑制浓度细胞凋亡线粒体途径Abstract4-(3,3-dimethylallyloxy)-5-methyl-6-methoxyphthalide(DMMP)isanaturalbiologicallyactivesubstancebelongtophenolphthalein,whichwasisolatedfromentophyticfungiPestalotiopsisphotiniae.The50%inhibitoryconcentration,IC50,ofDMMPoncellswascalculatedbyMTTassay.TheIC50forHeLa,MCF7,MDA-MB-231andMRC5cellswere36,54,78and123μg/mL.DMMPhadthemostantiproliferativeeffectonHeLacellline,andthenormallungfibroblastcelllineMRC5wasleastsensitivetoDMMP.WealsotestedtheIC50forHeLafordifferenttime,theywere36μg/mLfor24hours,22μg/mLfor48hours,and13μg/mLfor72hours.TheMTTassayresultshowedthatDMMPhadsomeselectiveanti-tumoreffect,anditcaninhibittheproliferationofcancercellstestedinaconcentration-dependentandtime-dependentmanner.MorphologychangesofcellnucleidetectedbyDAPIstrainingshowedthecharacterofapoptosis.JC-1strainingresultshowedthatDMMPcaninducethedecreaseofmitochondrialtransmembranepotential.FlowcytometryusedtodetectedtheapoptosisfoundthatDMMPcancausethedeathofHeLacellsbyapoptosis,anditcanarrestcellcyclesattheG1/Sphase.Dependingontheresultsoffirstseveralchapters,wedetectedrelativeproteinsandgenesofmitochondrialapoptosispathwaybythemeansofWesternblotandRT-qPCR.Resultsshowedth