实验性肌炎动物模型制作及il-6在其肌肉组织中表达的分析-establishment of experimental myositis animal model and analysis of il - 6 expression in its muscle tissue.docxVIP

独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日引言特发性炎性肌病（idiopathicinflammatorymyopathies,IIM）是一组以侵犯骨骼肌为主的，获得性、慢性、炎症性、系统性、自身免疫性的结缔组织疾病[1]。基于临床、病理及免疫组化特点主要分为多发性肌炎（polymyositisPM）、皮肌炎（dermatomyositisDM）及包涵体肌炎（inclusionbodymyositisIBM）等三种主要亚型。迄今为止，其具体病因和发病机制并未完全被阐明，大量研究表明自身免疫机制是这类疾病发生、发展的关键环节。细胞因子和细胞趋化因子在IIM启动和进展中起了重要作用[2]。目前研究表明DM主要是微循环参与的体液免疫介导的自身免疫性疾病，膜溶解攻击复合体（MembraneAttackComplexMAC）沉积于肌肉毛细血管内皮，导致其肿胀、变性、坏死以及血管周围炎症，血管壁增厚，甚至闭塞，毛细血管数量减少，最终导致肌肉缺血坏死[3,4]，浸润的炎性细胞大都是CD4+T，B淋巴细胞和树突状细胞。PM及IBM多认为是CD8+T细胞毒介导的侵袭MHC-I阳性的非坏死肌纤维的免疫性疾病。细胞因子和趋化因子是上述淋巴细胞活化和迁移的至关重要的参与者，但其具体的作用机制并不十分清楚。白介素-6是由多种类型细胞产生的多功能细胞因子，能调节免疫应答和炎症反应等[5]。其在炎症和免疫反应中的信号调节失常可能导致一些疾病的开始和维持，如炎症性肠病、骨髓炎、多发性硬化等[6]。它主要通过调节淋巴细胞分化和向炎症区域募集及上调其他细胞因子和趋化因子等发挥作用[7,8]。而且，它在许多实验性自身免疫性疾病中也扮演着重要角色，如在诱导型风湿性关节炎，实验性自身免疫性脑脊髓膜炎等过程中发挥着重要作用[9,10]。相比之下，目前国内外对于IL-6在炎性肌病中的研究相对较少。综上所述，由于IIM的异质性，慢性及复杂性，为了进一步探讨其病理特点及其相关细胞因子在其中可能起到的作用，我们迫切需要建立一个合适的，易操作及可复性较强的炎性肌病动物模型。本文利用免疫注射的方法制成实验性肌炎动物模型，并在此基础上探讨IL-6在其肌肉组织中的表达及其可能起到的作用，为治疗提供可能依据。材料和方法一、实验材料1.试剂和仪器纯化的兔骨骼肌肌球蛋白5mg/0.5ml（美国sigma公司）弗氏完全佐剂（美国sigma公司）百日咳菌液（北京天坛生物制品研究所）anti-CD4抗体（1:100），anti-CD8抗体（1:100）（均由谷歌生物公司提供，购于博奥森公司）anti-CD68抗体（1:200），anti-IL-6（1:300）（均由谷歌生物公司提供，购于Santa公司）两步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒（购于DAKO公司）。ROCHE型全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）。2.实验动物和分组20只健康雌性豚鼠（普通级动物标准），体重260~310g,6-12周龄(由湖北省实验动物研究中心提供)。根据随机数字表分为两组：实验组：12只,对照组：8只。两组均观察到第六周末后，处死动物。3.免疫方法A组为模型组，免疫物为：0.25ml（20ug/ml）/只纯化的兔肌球蛋白+等量的弗氏完全佐剂（CFA）。B组为对照组，免疫物为：0.25ml弗氏完全佐剂（CFA）+等量的1×PBS。每周免疫1次,连续6周。免疫注射方法为皮下注射，背部两侧，注射前均需充分混匀。前两周，在注射免疫物的基础上，两组均同时给于约2ug百日咳菌液的腹腔注射[11]。二检测指标及方法1.临床症状评分测定每周免疫注射前测豚鼠体重，并根据豚鼠活动情况,参照LennonLA评分方法[12]对两组豚鼠进行评分。评分标准：0分，肌无力无明显表现；1分，动物无力叫喊或咬啮；2分，静息时体位隆起，头下垂，行走颤抖；3分，肌无力较严重，体重明显减轻，甚至肌肉萎缩，不鸣叫，呼吸费力，近于死亡（表现居中者为