嗜热木聚糖酶的克隆 表达及酶学性质分析-cloning, expression and characterization of thermophilic xylanase.docxVIP

嗜热木聚糖酶的克隆、表达及酶学性质研究摘要木聚糖是自然界第二大丰富的多聚糖，来源十分广泛，但由于其复杂的结构，导致其降解困难，往往需要多种酶的协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖，在木聚糖的降解过程中起到关键作用。在已报道的木聚糖酶中，不同微生物来源的木聚糖酶具有不同的理化特性，分子量主要分布于20-40kDa，最适pH为2-11。木聚糖酶具有广阔的工业应用前景，但由于其酶活低、成本昂贵、酶的稳定性差等原因，大大限制了木聚糖酶在工业上的应用。CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725是木聚糖酶产生菌株，其生长温度为70-76℃，但培养条件困难，周期长。经过序列比对发现其基因组中701714-703783区域的2070bp的核苷酸编码木聚糖酶基因，命名为xyn10C，它与其它基因具有较低的同源性。我们由此推断，它所编码的酶是一类新型嗜热木聚糖酶。我们克隆出该基因并导入大肠杆菌中成功表达，进一步对木聚糖酶Xyn10C分离、纯化并测定其酶学特性。结果显示，Xyn10C在大肠杆菌内具有极高表达效率，并具有良好的热稳定性和木聚糖酶活性。经纯化后，纯化倍数为1.56，其纯度在94%左右，由于其与镍柱结合牢固，在纯化时造成大量蛋白损失，纯化效率仅为22.1%。酶学性质III表征显示，Xyn10C的最适pH是6.7-7.0，最适宜反应温度是68℃，并且有较好的热稳性。利用同源建模，推测出Xyn10C的三维结构模型，并对其进行序列比对推测出其催化残基Glu466和Glu574，该结果对木聚糖酶的研究有重要意义。Xyn10C菌株培养成本低、表达率高、耐高温，热稳性好等特质使其具有良好的工业应用潜质，未来经过进一步的分子改造，将具备重要的工业应用价值。关键词：嗜热木聚糖酶，酶的表征，CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725IIABSTRACTXylanisthesecondmostabundantpolysaccharidefiberinnature.Becauseofitscomplexstructure,thecompletelydegradationofxylanneedsthecooperationofmanykindsofhydrolases.Endo-1,4-β-xylanasecanhydrolyzeinternalβ-1,4-bondsofxylan,catalyzingitintoxylooligosaccharidesandD-xylose,andtherefore,isoneofthemostimportantenzymeforthedegradationofxylan.Themulti-strainoriginsofxylanasecontributetodistinctphysicalandchemicalproperties.Theirmolecularweightrangemostcommonlyfrom20to40kDa.TheoptimalpHvariesbetween2.0and11.0.BasedonstructuresandcharacterizationsofXylanases’catalyticregions,theycanbedividedintodifferentfamilies.Thoughawiderangeofpotentialapplicationsinvariedindustries,Xylanaseintrodutionencounteredseveraloffsettingconditionssuchaslowenzymeactivity,dissapointingIIIpH/thermalstabilityandprohibitivecostThesedrawbacksdirectlyamountedtolimitedadoptationofXylanaseindailyindustrialprocess.Here,wofocusedonthexylanase-makingthermophilicbacteriaCaldicellulosiruptorbesciiDSM6725.ThegrowthtemperatureofCaldicellulosiruptorbesciiDSM6725wasashighas70-76℃.Thesequenceanalysisofthestrain’sgenomerevealed701714-703783regionmayserveasapotentialxylanasegenewhichsharedlowhomogeneity.WededucedXyn10C-coded