肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法ppt课件.ppt

第六节 抗肿瘤药物体外研究方法; 用体外细胞作抗癌药筛选具有用药量少, 周期短, 费用低等优点。体外筛选结果与体内试验的相关性好, 因此, 抗癌药体外筛选已作为常规的抗癌药初筛手段。; 然而,体外研究方法也有一定局限性，主要是体内环境极为复杂，与体外实验环境有很大差别，体外筛选的最大缺点是无法获得药物对组织选择性方面的资料。此外, 有些药物须在体内代谢活化 (如环磷酰胺)或通过机体反应(生物调节剂)才能对肿瘤细胞起作用, 因而不能通过体外筛选寻找。 ; 目前世界上已建立了很多体外肿瘤细胞系(株)。药物筛选应选用生长特性稳定, 增殖快, 对已知抗癌药敏感的细胞系。小鼠与人的瘤细胞系对药物的反应大致相同, 前者具有在体内外均可进行试验的优点, 故较常应用。; 观察药物对肿瘤细胞体外生长的抑制作用，可选择10~15种以上肿瘤细胞系(株)进行体外研究，受试药用5个或5个以上不同浓度，观察药物对细胞形态、细胞存活、细胞膜功能、生长曲线、克隆形成能力等指标的影响。每项指标各有其优缺点，因此，应根据实际情况将几项指标组合起来应用。 ; 一、体外培养肿瘤细胞的生长和增殖特性 细胞生长是指细胞体积的增大，细胞增殖是指细胞数目的增多。体外培养的细胞生长增殖到一定密度时，则需进行传代(passage)。细胞每传一代后，一般要经历潜伏期、对数生长期和停滞期(平台期)3个阶段。 ;* 在指数生长期，取细胞数的对数与培养时间作图，可得一条斜率向上的直线，故也称此期为对数生长期，约3~5 d; 体外培养的肿瘤细胞按其生长方式可分为贴附生长型和悬浮生长型两大类: 贴附生长型: 细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，有时也称为贴壁生长。; 二、MTT法(√√)  [基本原理] MTT是一种溴化四氮唑, FW:414.3, 是能接受氢原子的染料。 MTT可进入细胞内，活细胞线粒体中脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臢, 而死细胞则无此功能。甲臢的生成量通常与活细胞数成正比, 在一定波长下用酶标仪测定吸光度值(A), 即可定量测出细胞的存活率。; [试剂与器材] 1.MTT溶液 用生理盐水或PBS配制成5 mg/ml贮存液，在磁力搅拌机上搅拌30min使之完全溶解。用前通过0.22μm滤膜除菌和沉淀物，4℃避光保存，两周内有效。呈黄色,无沉淀。暂时不用，可冻存。 2.含10%胎牛血清RPMI1640培养液，不含酚红指示剂；0.25%胰酶消化液；DMSO原液（分析纯）,作为甲臢的溶解液。; [试剂与器材] 3. 96孔培养板(用新的）,血细胞计数板，微量移液器，微型振荡器，CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪。 ; [操作步骤] 1.选用对数生长期的贴附肿瘤细胞→0.25%胰酶消化→悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(完全培养液)→吹打成细胞悬液。 2.用台盼蓝拒染法检测,活细胞应在97%以上。 若是悬浮生长细胞, 可直接用台盼蓝排染法计数活细胞。; 3.96孔培养板每孔加入细胞悬液190μl，每孔含5000~40000个细胞(根据细胞的类型而定)。接种后，37℃、5%CO2预培养24h。 4.将受试药物配成终浓度的20倍。受试药可用DMSO、培养液或生理盐水溶解。可设5~7个浓度组。 ; 5.加药组每孔加入10μl药液。因接种的细胞悬液体积为190μl，又加入了10μl药液，因此药液被稀释了20倍，等于所需要的终浓度。每组设3~5个平行孔,最好5个。 6.细胞在37℃、5%CO2培养箱中连续培养48h。然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl，继续培养4h。; 7.小心吸弃孔内上清液(若为悬浮培养的细胞，需1000r/min离心5min后再吸弃上清)。每孔加入150μl DMSO，微型振荡器上振荡约10min，使甲臢结晶完全溶解。 ;8.设置对照组 ： 空白对照孔(调零孔)：培养液、MTT和DMSO。 实验对照组：细胞、相同浓度溶解药物的溶剂 培养液、MTT和DMSO。 加药组 ：细胞、受试药物、培养液、MTT和DMSO. 阳性药对照组: 操作步骤同加药组。; 9.用酶标仪在570nm波长测定每孔的A值(参考比波长450nm)。测定时以空白对照孔调零。应尽快完成测定。;[结果评定] 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率： ? 实验对照组平均A值－加药组平均A值 肿瘤细胞生长抑制率(%)＝