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南京农业大学 生命科学学院 分 子 生 物 学 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 2 第五章 分子生物学研究法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 2018-8-5 2 南京农业大学 生命科学学院 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 3 第五章 分子生物学研究法（上） 2018-8-5 3 南京农业大学 生命科学学院 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 4 第五章 分子生物学研究法（上） 2018-8-5 4 南京农业大学 生命科学学院 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 5 第五章 分子生物学研究法（上） 内容： 重组DNA技术回顾 DNA基本操作技术 RNA基本操作技术 基因克隆技术 蛋白质组与蛋白质组学技术 2018-8-5 5 南京农业大学 生命科学学院 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 6 第一节 重组DNA技术回顾 2018-8-5 6 南京农业大学 生命科学学院 三大成就 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 7 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 7 重组DNA技术历史上的主要事件 年份 事 件 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。 1964  C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 8 2018-8-5 南京农业大学 生命科学学院 8 1965  S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定； 科学家证明细菌的抗药性通常由质粒DNA所决定。 1966  M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。 1978  首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠； A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 2018-8-5 南京农业大学