体外诱导人羊膜上皮细胞分化为结膜上皮样细胞的实验分析-experimental analysis of inducing human amniotic epithelial cells to differentiate into conjunctival epithelioid cells in vitro.docxVIP

暨南大学硕士学位论文体外诱导人羊膜上皮细胞分化为结膜上皮样细胞的实验研究 暨南大学硕士学位论文 体外诱导人羊膜上皮细胞分化为结膜上皮样细胞的实验研究 目 录 中文摘要 错误!未定义书签。 Abstract 错误!未定义书签。 目录 III 前言 1 1．结膜的组织结构和功能 1 2. 结膜重建的主要治疗方法 1 3. 组织工程结膜的研究进展 1 4. 人羊膜上皮细胞的干细胞特性及其在结膜重建的应用前景 3 第一部分 人羊膜上皮细胞和兔结膜上皮细胞的体外培养及鉴定 5 1. 材料和方法 5 2. 结果 10 3. 讨论 11 第二部分 诱导人羊膜上皮细胞向结膜上皮样细胞转分化及鉴定 13 1. 材料和方法 13 2. 结果 19 3. 讨论 20 全文总结 23 参考文献 24 附图 29 在学期间发表论文 42 致谢 43 III 1 1 前言 1. 结膜的组织结构和功能 结膜是覆盖在眼睑后面和眼球前面的一层薄而透明的黏膜，按解剖部位不同可分为睑 结膜、球结膜及穹窿结膜三部分是眼表的重要组成部分。组织学上分为上皮细胞层和固有 层，其中上皮层由复层非角化上皮细胞组成，其间散在分布着可分泌粘液的杯状细胞。杯 状细胞是单细胞粘液腺，以顶浆分泌形式分泌粘液，构成泪膜的粘蛋白层，覆盖于结膜及 角膜上皮的表面，其亲水性强，对泪膜的稳定起着重要作用。因此，当结膜受到大面积损 伤如眼部化学伤、热烧伤、复发性翼状胬肉等眼表疾病时，将丧失正常功能而导致角膜结 膜化、眼球运动受限甚至视力丧失，同时由于结膜杯状细胞的损失也会影响粘蛋白的分泌 从而导致泪膜的稳定性下降。 2. 结膜重建的主要治疗方法 目前针对结膜组织严重损伤常用的治疗方法是用正常的结膜或结膜替代物进行结膜 重建，主要有自体结膜移植、自体黏膜移植、羊膜移植等[1]。自体结膜是结膜重建材料的 最佳来源，但往往面临双眼受累、取材面积有限的问题。唇黏膜的解剖结构和生理功能均 不同于结膜，移植术后分泌过多。羊膜的组织结构与结膜相似，无免疫原性，且具有抑制 新生血管促进上皮细胞生长[2]等作用，故在结膜重建中倍受青睐。但羊膜不能提供上皮细 胞和杯状细胞，无法真正替代结膜，故对于大面积结膜缺损很难恢复理想的结构与功能[3-5]。 同种异体结膜移植材料来源有限，而且往往由于排斥反应而引起手术失败[6]。 3. 组织工程结膜的研究进展 由于可用于移植的自体结膜有限，具有良好组织配型的异体结膜的获得相当困难，其 他结膜替代物无法从功能上取代结膜组织，考虑到现有各种临床治疗方法所存在的弊端， 学者们开始把目光转向组织工程结膜的研究，希望发现一种来源充分、容易操作、低免疫 原性或无免疫原性的新型“种子细胞”，能够定向诱导分化为正常的结膜上皮用于眼表重 建。理想的方法是运用组织工程技术，选择合适的“种子细胞”，体外培养、构建具有分 泌和防御等正常生理功能的组织工程结膜。 干细胞是指具有一定自我更新能力和分化潜能的细胞，根据分化潜能的不同可将其分 成三类，即全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。全能干细胞和多能干细胞均具有多项 分化潜能，区别在于全能干细胞可发育成为一个完整的个体，如胚胎干细胞。而多能干细 PAGE PAGE 2 胞则不具有发育成完整个体的能力，如骨髓多能造血干细胞。单能干细胞又称为专能干细 胞，只能向特定的一种类型或与之密切相关的两种类型细胞分化的干细胞，如结膜上皮干 细胞。目前结膜组织工程重建尚处于探索阶段，选取合适的“种子细胞”要求其容易获得， 来源丰富，增殖力强，活性良好。当前已经有国内外学者对组织工程结膜重建的“种子细 胞”进行了一些有益的探索。 3.1 结膜上皮干细胞 眼球表面除角膜上皮干细胞还存在结膜上皮干细胞，它是结膜上皮中杯状细胞和非杯 状细胞的共同祖细胞。目前关于结膜上皮干细胞的存在部位有以下几种观点，即位于穹窿 部[7,8]、皮肤黏膜交界处[9,10]、弥散分布于穹窿部及球结膜[11]或位于睑结膜[12]。国外有学者 将结膜上皮细胞通过单克隆培养的方式得到后，再接种到裸鼠皮下，以此对单个细胞的分 化潜能进行研究分析，结果证实结膜上皮干细胞是双潜能祖细胞，可产生杯状细胞和非杯 状细胞系两个子细胞系[11]。Meller等[13]在以羊膜为基质的载体上培养结膜上皮祖细胞，再 将培养后的细胞导入体内，发现其可分化为杯状细胞和非杯状细胞。应用自体结膜上皮干 细胞作为组织工程结膜的种子细胞是理想的选择，但仍存在一定的缺陷。首先其取材会对 机体造成伤害，尤其是对于双眼受累的患者，另外其分离培养操作难度大。 3.2 胚胎干细胞 胚胎干细胞在一些调控因子的诱导下可向某一类或相关的一族细胞方向分化，然而其 发育分化是一个多因素