检测试剂盒反向斑点杂交法.DOC

人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒使用说明书 （PCR-反向斑点杂交法） 【产品名称】 通用名称：人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法） 英文名称：Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types（PCR-RDB） 【包装规格】25人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）并加以分型，对宫颈癌的早期诊断有重要意义。 【检测原理】反向斑点杂交法 本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物，PCR扩增各基因型HPV的目的片段。将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。根据生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system,BAS）原理，将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交，洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素（POD），与PCR产物上的生物素结合。加入显色液（TMB，H2O2），辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解，TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。 本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型，其中包括19种高危亚型：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83型；13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、69、70、72、81型。 【主要组成成分】 组成成分 规格 数量 核酸扩增组分 PCR反应液 20μL/管 25管 阴性质控品 10μL 1管 阳性质控品 10μL 1管 杂交组分 裂解液 2.5mL 2管 POD 75μL 1管 30% H2O2 75μL 1管 TMB 10mL 1瓶 膜条 - 25张 【自备试剂】 1、20×SSC:称取 175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水，用800mL双蒸水溶解，浓HCl调节pH值至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，室温保存。 2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中，浓HCl调节pH值至7.0，定容至200mL，高压灭菌，室温保存。 3、1M柠檬酸钠：294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解，用浓HCl调pH值至5.0，定容至1000mL，室温保存。 4、A液：(2×洗膜缓冲液)将100mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到1000mL。 5、B液：（0.5×洗膜缓冲液)将25mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到1000mL。 6、C液：100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。 【储存条件及有效期】 核酸扩增组分（试剂盒 = 1 \* ROMAN I）于-20℃以下冷冻保存；杂交组分（试剂盒 = 2 \* ROMAN II）和核酸提取组分于2～8℃冷藏保存；TMB应避光保存。试剂有效期6个月。 【适用仪器】 核酸扩增仪：ABI-Veriti(USA)；Ependorf Gradient(German)；MJPTC-100(USA)；AB9700(USA)等。 分子杂交仪：亚能YN-H16（中国）；FYY-3（中国）等。 【样本要求】 1、检查前准备： 女性应在非经期；检查前24小时内不要有性行为，不要做阴道冲洗，不要阴道内用药。 2、标本采集： 医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。取出宫颈刷单方向旋转4~5周以获得足量的上皮细胞样本，然后放入洗脱管中，旋紧洗脱管盖，做好样本标识，保持洗脱管直立放置。 3、标本的保存及运送： 标本采集后，为得到准确的实验结果，原则上应尽可能快的送检，室温保存不超过12小时，2～8℃冷藏保存不超过7天，-20℃以下冷冻保存不超过1个月。如运送时间超过规定的一般要求，必须用冰盒保存送检。 【检验方法】 样本检验操作包括三个步骤：核酸提取；PCR扩增；杂交检测。 DNA提取： 1、 在1.5ml离心管中加入1mL细胞保存液保存的宫颈细胞，13000rpm离心5分钟，弃上清，保留沉淀。 2、在细胞沉淀中加入200μL DNA提取液，高速振荡15秒钟，使细胞沉淀与提取液充分混匀。 3、100℃15分钟。 4、室温下13000rpm离心5分钟，上清可以用于PCR反应。4℃或者-20℃保存备用。 二、PCR扩增 1、根据样本数目取出相应的PCR反应管（每个实验设一个阴性对照和一个阳性对照，即样本数+2），依次做好标记。低速离心数秒后备用。 2、在准备好的PCR反应管中加入5μL已提取的待测样本DNA（阴性对照、阳性对照同步处理），反应总体系为25μL，低速离心数秒。 3.1、PCR扩增条件