调节notch-1信号系统对高糖诱导心肌细胞损伤的保护作用及机制-protective effect and mechanism of notch - 1 signal system on myocardial cell injury induced by high glucose.docxVIP

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 目的： l.观察高糖对 H9c2 心肌细胞增殖、凋亡及纤维化的影响。 2.观察以 Notch-l 为靶点干预对高糖诱导的 H9c2 心肌细胞增殖、凋亡及纤 维化的影响。 3.探讨过表达 Notch-l 抑制高糖诱导的 H9c2 心肌细胞凋亡及纤维化的机制。 方法： l.体外低糖正常培养 H9c2 细胞，再分别运用高糖、y分泌肽酶抑制剂(DAPT) 和 Notch-l 过表达慢病毒进行干预。 .实验分六组：①Control 组：正常对照组，用 5.5mmol/L 低糖培养基培养 H9c2 细胞；②Mannitol 组：甘露醇高渗对照组，用含 33mmol/L 甘露醇的培养 基培养 H9c2 细胞；③High glucose 组：阳性对照组，用含 33mmol/L 葡萄糖的培 养基培养 H9c2 细胞；④DAPT 组：用 Notch-l 特异性阻断剂y分泌肽酶抑制剂 (DAPT)干预 H9c2 细胞；⑤Notch-l 组：感染 Notch-l 过表达病毒组；⑥GFP 组： 感染空载体慢病毒组。 3.DAPT 干预 48h，慢病毒感染 72h 后，用 CCK-8 试剂盒检测各组 H9c2 细 胞的增殖抑制率；应用 Annexin V-FTTC/PT 双染色后流式细胞仪测各组 H9c2 细 胞凋亡率并比较；同时应用 qRT-PCR 法分别测定各组 H9c2 细胞 PT3K、AKT mRNA 的表达；Western blot 法测定各组 H9c2 细胞 Notch-l、p-PT3K/p-AKT、Bax、 Bcl-2、TGF-βl、collagen T 蛋白的表达并比较。 结果： l.成功构建 Notch-l 过表达慢病毒载体，病毒滴度为 2xl08TU/ml；病毒感染 72h，MOT=40 时，病毒转染效率最强。 2.CCK8 试剂盒法测定各组 H9c2 心肌细胞增殖抑制率，结果显示：高糖可 使 H9c2 心肌细胞增殖抑制率增高，过表达 Notch-l 可使 H9c2 心肌细胞增殖抑 制率下降，DAPT 干预后 H9c2 心肌细胞增殖抑制率进一步增高，差异有统计学 意义（P0.0l）。 TT 3.Western Blot 法检测各组 H9c2 心肌细胞 Bax、Bcl-2 表达，结果显示：高 糖可使 Bax/Bcl-2 比值增高，过表达 Notch-l 可使 Bax/Bcl-2 比值减小，DAPT 干 预后 Bax/Bcl-2 比值进一步增高，差异有统计学意义（P0.05）。 4.应用 Annexin V-FTTC/PT 双染色后流式细胞仪测各组 H9c2 心肌细胞凋亡率 并比较，结果显示：高糖可使 H9c2 心肌细胞凋亡率增高，过表达 Notch-l 可使 H9c2 心肌细胞凋亡率减小，DAPT 干预后 H9c2 心肌细胞凋亡率进一步增高，差 异有统计学意义（P0.05）。 Western blot 法测定各组 H9c2 心肌细胞中 TGF-βl、collagen T 蛋白表达， 结果显示：高糖可使 TGF-βl 和 collagen T 表达上调，过表达 Notch-l 使 TGF- βl 和 collagen T 表达下调，DAPT 干预后可使 TGF-βl 和 collagen T 上调达最高 值，差异有统计学意义(P0.0l)。 qRT-PCR 法测定各组 H9c2 心肌细胞中 PT3K/AKT mRNA 含量并比较，结 果显示：高糖可使 PT3K/AKT mRNA 表达下调，过表达 Notch-l 可使 PT3K/AKT mRNA 表达上调，DAPT 干预后可使 H9c2 心肌细胞 PT3K/AKT mRNA 表达进一 步下降，差异有统计学意义(P0.05)。 Western blot 法测定各组 H9c2 心肌细胞 Notch-l、p-PT3K/p-AKT 蛋白的表 达，结果显示：高糖可使 Notch-l、p-PT3K/p-AKT 蛋白表达下调，过表达 Notch-l 可使 p-PT3K/p-AKT 蛋白表达上调，DAPT 干预后 p-PT3K/p-AKT 蛋白表达进一 步减少，差异有统计学意义(P0.05)。 结论： ⑴成功构建了 Notch-l 过表达的慢病毒载体，并高效感染 H9c2 细胞。 ⑵高糖可诱导 H9c2 心肌细胞发生凋亡及纤维化反应；过表达 Notch-l 能够 抑制高糖诱导的 H9c2 心肌细胞的凋亡和纤维化反应。 ⑶过表达 Notch-l 能够激活 PT3K/AKT 通路，使 AKT 磷酸化并调控下游 Bcl-2 家族蛋白的表达，还可以抑制 TGF-?l 的表达，进而使 collagen T 纤维化因子的表 达下调，并可能通过这