硒半胱氨酸解码相关因子rpl30 sbp2和efsec在硒蛋白p高效表达中作用研究-study on the role of selenocysteine decoding related factors rpl 30 sbp2 and ef sec in the high expression of selenoprotein p.docxVIP

佳木斯大学硕士学位论文 II II 学 术 诚 信 承 诺 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 佳木斯大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示 了谢意。 签名： 日期： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解佳木斯大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。 （保密的论文在解密后应遵循此规定） 签名： 导师签名： 日期： III III 目 录 一 中文摘要 Ⅳ 二 英文摘要 Ⅴ 三 前言 1 四 文献综述 2 五 材料与方法 14 六 结果 30 七 讨论 35 八 结论 37 九 参考文献 38 十 致谢 42 十一 英文缩写 43 PAGE PAGE IV 摘 要 目的：克隆 RPL30、SBP2 和 EFsec 三个反式作用因子基因，并构建其哺乳动物 细胞表达载体，然后与重组质粒 pcDNA3.1-iGFP-Sepp1 共转染 HEK293 细胞，研究 三个反式作用因子对硒蛋白 P 基因表达的影响。为实现硒蛋白 P 在哺乳动物细胞中 高效表达奠定基础。 方法：应用 RT-PCR 方法从人乳腺癌 MCF-7 细胞中扩增 RPL30 基因，利用双酶 切法将其连入真核表达载体 pcDNA3.1（+）；采用半合成-酶连法将 EFsec 基因中所 缺失的片段补齐，用 PCR 方法扩增拼接产物，将其克隆到真核表达载体 pcDNA3.1 （-）；真核表达载体 pCMV-XL4-SBP2 购自 OriGene 生物公司；将三个反式作用因 子表达质粒与硒蛋白 P 表达质粒按照不同的组合方式，采用脂质体转染法瞬时转染 HEK293 细胞；采用 RT-PCR 法检测三个反式作用因子的表达及其对硒蛋白 P 基因转 录水平的影响。 结果：成功克隆 RPL30 基因并构建其表达载体 pcDNA3.1-RPL30；准确地将 EFsec-基因补齐了其 5′端缺失的基因序列，并成功地构建了表达载体 pcDNA3.1- EFsec；RT-PCR 方法联合条带平均密度值分析证实，转染组与正常组相比，目的基 因 RPL30、SBP2 和 EFsec 的 mRNA 水平显著增高，表明转染成功并有效表达。 结论：反式作用因子 RPL30、SBP2 和 EFsec 基因哺乳动物细胞表达载体的成功 构建以及其超表达后对硒蛋白 P 基因转录水平的作用分析，为深入研究硒蛋白 P 的 生物合成机制打下了基础。 关键词：硒蛋白 P；反式作用因子；质粒构建；转染；高效表达 Abstract Objective: By cloning three trans-acting factor RPL30、SBP2 and EFsec genes, constructing their mammalian expression vectors, and transfecting them into HEK293 cells with plasmid pcDNA3.1-iGFP-Sepp1, to study the transcription of Sepp1, lay foundation for over expression of sepp1 in mammalian cells. Methods: The coding sequence of RPL30 gene was amplified by RT-PCR from human MCF-7 cells , then cloned into pcDNA3.1(+) vector by Double Digests; The missing fragment of EFsec gene was synthesized and connected to the 5’ end of EFsec by Partial Synthesis-Restrict Enzyme Ligation Method, then amplified by PCR and cloned into pcDNA3.1(-) vector; Eukaryotic expression plasmid pCMV-XL4-SBP2 was bought from OriGene biology company; The expression plasmids were tr