纤维素降解菌的分离 鉴定及产内切纤维素酶基因工程乳酸菌的构建-isolation and identification of cellulose-degrading bacteria and construction of endoglucanase - producing genetically engineered lactic acid bacteria.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 纤维素降解菌的分离、鉴定及产内切纤维素酶基因工程乳酸菌的构建 纤维素降解菌的分离、鉴定及产内切纤维素酶基因工程乳酸菌的构建 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中文摘要 纤维素酶作为饲料添加剂，可提高饲料利用率和粗饲料的营养价值，降低饲料成本， 在促进动物生长、减少粪便排放、改善生态环境和动物疾病防治等方面效果明显，同时 通过纤维素高效降解菌发酵处理秸秆，可以合成含有丰富蛋白质的菌体细胞,这些分解产 物和菌体亦可用于单细胞蛋白饲料。乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌,被公认为安全 级(Generally Recognized As Safe, GRAS)微生物。它作为一种益生菌，具有维持肠道菌群 微生态平衡、可激活机体粘膜免疫反应、抑制肠道内病原微生物的生长、增强动物机体 免疫力等多种生物学功能。另一方面，基因工程乳酸菌可以集益生和外源基因表达的双 重功能于一身，在功能食品、医疗保健、人工口服疫苗等领域的应用均具有诱人的前景。 本实验从奶牛、山羊瘤胃内容物以及腐烂饲草中通过羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平 板选择培养刚果红染色法初步筛选到能够产生明显透明圈的细菌菌株 18 株、真菌菌株 33 株，通过测定纤维素酶活性进行复筛，分离到高效纤维素降解真菌和细菌各一株作为 后续实验研究对象，通过克隆真菌 NL-3 的 18S rDNA 序列,并以其同源性为基础构建相 关种属的系统发育树。结果表明, 18S rDNA 序列全长 504bp, Blast 显示该菌株与青霉菌 属 同 源 ? NL-3 菌 株 在 进 化 关 系 上 也 与 青 霉 菌 属 (Penicillium) 聚 成 一 族 。 特 别 是 与 Penicillium decumbens strain JU-A10 的同源性最高,其序列相似性达 99%。结合菌株形态 学与 18S rDNA 基因序列分析对分离菌株进行鉴定，初步鉴定为青霉属的斜卧青霉 (Penicillium decumbens)。 同时克隆了细菌 N9 的 16S rDNA 序列。测序分析表明，其 16S rDAN 序列全长 1514bp。BLAST 显示该菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源。以同源性为基础构 建了相关种属的系统发育树，该菌株在进化关系上与枯草芽孢杆菌聚成一族；结合生理 生化特征及 16S rDNA 分子鉴定，将其鉴定为枯草芽孢杆菌。 根据 GenBank 上已发表的枯草芽孢杆菌内切纤维素酶(eg)基因序列,针对 pMG36e 质粒的多克隆位点设计引物，以枯草芽孢杆菌 N9 的基因组 DNA 为模板，扩增 eg 基因 序列。该基因序列全长 1518bp，通过序列比对分析，eg 与已报道的其它来源的内切纤 维素酶的序列相似性最高在 92%。并将其亚克隆至乳酸乳球菌表达质粒 pMG36e 中，构 建重组乳酸乳球菌表达质粒 pMG36e-eg。通过电转化方法将重组质粒转化至乳酸乳球菌 MG1614 感受态细胞，成功构建了产内切纤维素酶的基因工程乳酸菌。将此重组转化子 点接至含 CMC 的 M17 平板上能够产生透明圈，收集表达产物后通过进行 SDS 电泳、Western blot 检测到内切纤维素酶分子量约 54KD, 与预期结果相吻合。 本研究筛选到多株高效纤维素降解菌，并克隆了内切纤维素酶基因(eg)，构建乳酸 菌表达载体 pMG36e-eg，构建了重组内切纤维素酶基因工程乳酸菌。以期利用乳酸菌表 达系统得到高活性纤维素酶以及开发出产内切纤维素酶的多功能微生态制剂。 关键词：纤维素降解菌；鉴定；内切纤维素酶；乳酸乳球菌 Abstract Cellulose as a feed additive can improve feed utilization rate and nutritional value of fodder and reduce feed costs. It is obvious in the promotion of animal growth, reduction of dejecta, the ecological environment improve and animal disease control. Meanwhile, through the fermentation of cellulose-degrading strains bacterial cells rich in protein are synthesized which can be used for single cell protein feed. Lactococcus lac