稳定表达 hoctn12 细胞模型的构建及应用-construction and application of a stable hoctn 12 cell model.docx

万方数据 万方数据 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1、保密□，在_ _年解密后适用本授权书。 2、不保密□。 （请在以上相应方框内打“√”） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 浙江工业大学硕士学位论文中文摘要 浙江工业大学硕士学位论文 中文摘要 万方数据 万方数据 稳定表达 hOCTN1/2 细胞模型的构建及应用 摘 要 目的：构建稳定表达人肉碱/有机阳离子转运体 1 和 2 ( hOCTN1/ hOCTN2 ) 的细胞模型；考察抗精神病药物 WY-01 与 hOCTN1 和 hOCTN2 的相互作用，以 及有机阳离子类转运体在 WY-01 肾脏跨膜转运中的作用。 方法：（1） 从人肾组织中提取 hOCTN1 和 hOCTN2 基因，构建获得重组 质粒 pcDNA3.1(+)-hOCTN1 和 pcDNA3.1(+)-hOCTN2，分别转染 MDCK 细胞， 经 G418 抗性筛选挑取单克隆细胞株。经麦角硫因 ( hOCTN1 经典底物 ) 或米屈 肼 ( hOCTN2 经典底物 ) 的细胞积聚研究，得到高活性的 MDCK-hOCTN1 和 MDCK-hOCTN2 单克隆细胞。 （2） 应用 MDCK-hOCTN1 和 MDCK-hOCTN2 细胞模型，考察 WY-01 对 hOCTN1 和 hOCTN2 的抑制作用，并进一步考察 WY-01 是否为 hOCTN1 或 hOCTN2 的底物。 （3）应用稳定表达人有机阳离子 转运体 2 ( hOCT2)、人多药及毒素外排转运体 1 和 2K ( hMATE1、hMATE2-K ) 及瞬转人小肽转运体 2 ( hPEPT2 ) 的细胞模型，进行细胞积聚研究，考察 WY-01 是否为上述转运体的底物。 结果：（1） 本研究构建的 MDCK-hOCTN1/2 细胞与转染空载体的 mock 细 胞相比， hOCTN1/2 mRNA 表 达 量 显 著 升 高 ， 经 典 底 物 麦角硫因 在 MDCK-hOCTN1 细胞上的积聚量为转染空载体细胞的 122 倍，Km 和 Vmax 为 8.19 ± 0.61 μmol/L，1427 ± 49 pmol/mg protein/min；米屈肼在 MDCK-hOCTN2 细 胞上的积聚量为 mock 细胞的 108 倍，Km 和 Vmax 为 52.3 ± 4.3 μmol/L，2454 ± 64 pmol/mg protein/min。上述结果表明，稳定高表达 hOCTN1/2 的细胞模型构建成 功，可应用于药物与 hOCTN1/2 相互作用研究。 （2） WY-01 对 hOCTN1 和 hOCTN2 介 导 的 经 典 底 物 摄取 有 抑 制 作 用 。 进 一 步 研 究 发 现 ， WY-01 在 MDCK-hOCTN1/2 细胞上的积聚显著高于 mock 细胞，且可被 hOCTN1/2 抑制 I 剂麦角硫因或左旋肉碱抑制，提示 WY-01 为 hOCTN1 和 hOCTN2 的底物，且 hOCTN1 介导 WY-01 的转运呈 H+ 依赖性。 （3） 应用稳定表达 hOCT2、 hMATE1、hMATE2-K 和瞬转 hPEPT2 的细胞模型，阐明了 WY-01 为 hOCT2、 hMATE1 和 hMATE2-K 的底物，但不是 hPEPT2 的底物；细胞积聚动力学参数 显示，在 Vmax 方面，hMATE2-K hOCTN1 hMATE1 ≈ hOCT2 hOCTN2；在 Km 方面，hOCT2 hOCTN2 ≈ hOCTN1 hMATE2-K hMATE1；在 Clint 方面， hMATE2-K hMATE1 hOCTN1 hOCT2 ≈ hOCTN2。 结论： （1） 本研究构建的 MDCK-hOCTN1 和 MDCK-hOCTN2 细胞模型 可用于药物与 hOCTN1/