胃癌血管靶向蛋白gx1-rmhtnfα的发酵纯化工艺-fermentation and purification of vascular targeting protein gx1 - rmh tnf α in gastric cancer.docxVIP

- - 缩略语表 缩略词 英文全称 中文全称 aa amino acid 氨基酸 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 bp base pair 碱基对 EC endothelial cell 内皮细胞 ECT emission computed tomography 计算机断层显像 E.coli escherichia coli 大肠杆菌 EDTA ethylenediaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸 EGF Epidermal growth factor 表皮生长因子 ELISA enzyme-linked immunoadsordent assay 酶联免疫吸附试验 FGF Fibroblast growth factor 成纤维细胞生长因子 HPLC High Performance Liquid Chromato graphy 高效液相色谱 HUVEC Human umbilical vein endothelial cell 人脐静脉内皮细胞 LB Luria-Bertani medium LB 培养基 MTT Methyl thiazolyl tetrazolium 甲基噻唑基四唑 MVD micro-vessel density 微血管密度 OD optical density 吸光度 PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PIGF placental growth factor 胎盘生长因子 PHD- C7C  Ph.D.-C7CTM phage display peptide library  噬菌体随机环 7 肽库 SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠 SPECT Single photon mission computed 单光子计算机断层显像 缩略词 英文全称 中文全称 TEMED tetrametyl ethylene diamine 四甲基乙二胺 TNFα Tumor necrosis factor alpha 肿瘤坏死因子 α 重组改构人肿瘤坏死因 rmhTNFα Recombinant mutant Human TNFα 子 rpm revolutions per minute 每分钟转速 VEGF Vasclar endothelial growth factor 血管内皮生长因子 VPF Vascular permeability factor 血管通透因子 胃癌血管靶向蛋白 GX1-rmhTNFα 的发酵纯化工艺 中文摘要 胃癌是一种最常见的人类恶性肿瘤，居全球癌症死亡率的第二大原 因，预后较差，在我国，5 年期胃癌的生存率低于 20%-25%。早期胃癌 可以通过手术切除，辅以放化疗治疗，极大提高患者的 5 年生存率。可 是中晚期胃癌治疗效果较差。随着人们对肿瘤研究的深入，人们意识到 肿瘤生长微环境，尤其是肿瘤的血管生成，对肿瘤的生长转移的重要 性。因此阻断肿瘤血管生成成为了人们研究肿瘤治疗的新方向。 GX1-rmhTNFα 是我们实验室采用基因重组技术制备的一种抑制胃癌 新生血管形成的药物。rmhTNFα 在我国已经批准上市用于治疗小细胞肺 癌，GX1 为我实验室通过噬菌体肽库筛选出来的靶向胃癌血管的环状小 肽，于是我们采用基因重组技术制备出 GX1-rmhTNFα。前期实验证明 该药物通过 GX1 特异结合于胃癌新生血管，从而使 rmhTNFα 在胃癌细 胞周围的新生血管富集，能有效地抑制胃癌血管生成，达到治疗胃癌的 作用。 目的:为了进一步加快 GX1-rmhTNFα 应用于临床治疗，本课题旨在 通过全面检定采用基因重组技术构建的表达 GX1-rmhTNFα 融合蛋白的 工程菌(DH5α/pBV-GX1-rmhTNFα)，从而建立稳定的适合大规模生产的 工程菌菌种库，并建立发酵及纯化的稳定工艺。方法:对 GX1-rmhTNFα 工程菌进行全面检定，挑取目的蛋白表达水平高的菌种扩大培养；采用 5L 发酵罐，32℃培养工程菌至 A600 值达 4～6，42℃诱导约 4h 后收菌， 发酵过程，控制 pH 值在 7.2，溶氧在 30%左右，采用梯度流加的方法补 料，连续发酵 3 批，验证发酵工艺的稳定性；表达产物经硫酸铵分段盐 析及透析处理后活性为 1.71×108IU/ml 蛋白含量为 5.918mg/ml，经 SP- Sepharose FF 及 Q-Sepharose FF 层析纯化，收集洗脱峰进行浓度、活 性、纯度及 Western blot 分析。结果:工程菌经全面检定，证实该重组菌 构建正确，目的蛋白表达量不低于 10%，菌种稳定性较好，呈典型的大