4种方法制备外周血淋巴细胞总RNA对鹅α干扰素影响比较.docVIP

4种方法制备外周血淋巴细胞总RNA对鹅α干扰素影响比较 　　摘要：无菌采取鹅外周血并进行抗凝处理，以全血提取法、细胞分离直接提取法、细胞分离培养提取法及细胞分离诱导提取法分别提取外周血中淋巴细胞的总RNA；紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率；以总RNA为模板通过RT-PCR法扩增鹅α-干扰素（GoIFN-α）基因，并构建重组质粒pGEMT-α，通过比较GOIFN-α序列确定各种提取方法的可行性。结果显示，4种方法提取的RNA纯度高，均可作为模扳扩增出目的基因，满足后续的分子生物学研究；其中以细胞分离直接提取法制备的RNA产量最多，此结论为外周血淋巴细胞总RNA的提取提供了一种更快捷的方法。 　　关键词：外周血；淋巴细胞；RNA提取；RT-PCR；方法比较；鹅；干扰素 　　中图分类号：S858.33 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0204-02 　　干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂且具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。刺激产生干扰素的外源因素主要有病毒和其他种类的干扰素诱导剂，如植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）。在外源因素刺激下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，从而获得丰富的含有丝分裂且生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，提取总RNA并反转录，即可得到1个表达细胞因子的cDNA库。多个报道显示，为获取目的基因，一般在外源因素刺激后再提取外周血淋巴细胞总RNA，本研究尝试采用多种方法制备总RNA并扩增目的基因，以探索一种最为快捷简便的外周血淋巴细胞总RNA提取方法，为其他细胞因子的分离奠定基础。 　　1.材料和方法 　　1.1试验材料 　　成年扬州白鹅购自扬州瑞农科技有限公司；刀豆球蛋白（conA）购自Sigma公司；Trizol购自Invitrogen公司；禽淋巴细胞分离液购白天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase、RNaseInhibitor、TaqDNA聚合酶、1kbDNALadderr、PrestainedProtein分子量marker、pGEM-TEasyVectorSystem、限制性内切酶、质粒提取试剂盒购自美国Promega公司；胶回收试剂盒、细胞培养液、细胞消化液、DH5cα大肠杆菌感受态细胞购自康为世纪生物科技有限公司。 　　1.2引物设计与合成 　　根据已发表的GoWN-α基因序列（登录号：HQll5583）设计1对引物，拟扩增的全长序列为576bp。引物F1：5-ATGCCTGGGCCATCAGCCCCAC-3和R1：5一TTAGCGCAT―GGCGCGGGTGAGG-3由上海Invitrogen公司合成。 　　1.3总RNA提取 　　1.3.1细胞分离诱导提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翼静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞，加入含10%小牛血清的RPMI-1640细胞培养液并吹匀，计数后稀释至2×106个/mL。用终浓度64mg/LConA刺激诱导，于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后，收集细胞并按Trizol试剂说明书提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。 　　1.3.2细胞分离培养提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翅静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞，后将其重悬于含10%小牛血清的RPMI一1640细胞培养液中，计数后稀释至2×106。个/mL，于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后，按Trizol说明书提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。 　　1.3.3细胞分离直接提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翼静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按淋巴细胞分离液说明书分离淋巴细胞，用PBS重新悬浮，反复洗涤2～3次后按Trizol说明书提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。 　　1.3.4全血提取总RNA使用无菌注射器采取鹅翼静脉血5mL，3.8%枸橼酸钠抗凝。按Trizol说明书直接提取总RNA，通过紫外分光光度仪测其纯度和浓度。 　　1.4GoIFN-α基因的RT-PCR扩增 　　GOIFN-α基因的反转录（RT）：取上述4种RNA悬浮液各5μL，参照反转录酶说明书，均选用特异性引物R1分别合成cDNA第1链，RT产物各自标记岳于20℃保存。 　　GolFN-α基因的PCR扩增：取上述4种RT产物各2μL为cDNA模板，分别加入MixTaqDNA聚合酶25μL，上、下游引物（F1、R1）各1μL，超纯水补足至各反应体系均50μL，混匀后参照下列反应程序进行PCR扩增。反应程序：