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MADS―box基因在小麦幼胚脱分化过程中差异分析 　　摘要：本研究首次在小麦幼胚脱分化过程中利用Affymetrix小麦基因芯片技术对MADS―box基因表达变化进行检测，共检测到20个MADS-box基因，其中14个基因下调表达，6个基因混合表达。这些基因大量下调表达，推测其在小麦幼胚脱分化中具有较强的抑制作用。此外发现，12 h是小麦幼胚脱分化过程中MADS-box基因表达的一个关键时期。选取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992四个基因进行半定量RT-PCR验证，检测结果与小麦基因芯片结果基本一致。 　　关键词：小麦；MADS-box基因；基因芯片；幼胚；脱分化 　　中图分类号：S512.101：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001―4942（2016）03―0009―05 　　MADS-box基因是由酵母中的MCM1、拟南芥中的AG、金鱼草中的DEFICIENS和人类中的SRF4种MADS-box基因的首字母缩写而成。MADS-box基因家族是一类序列特异的多基因家族，其所编码的MADS-box蛋白即为MADS-box转录因子，它以多聚体的形式通过其保守结构域与特定的DNA序列结合来调控基因表达，其主要功能表现为激活或抑制靶基因的转录反应。在许多植物基因组中存在数量不等的MADS-box重复基因，研究较早较多的植物是拟南芥、金鱼草和矮牵牛，之后在水稻、油菜、罂粟、豌豆、番茄、葡萄、玉米、小麦等多种植物中也发现了MADS-box基因的存在。MADS-box基因具有多种生物学功能，它不仅与植物花器官的发育、花时的调控以及其它生殖生长过程有关，而且也在根的形成、叶的生长和植物抗逆反应中起作用，其中，在拟南芥根部表达的MADS―box基因至少有50个。随着研究的深入，人们对MADS―box基因的研究逐渐拓展到小麦上来。研究发现，TaVRT-1基因在春化诱导的植物中表达，该基因Vrn-1区域与春化处理和耐冬性有关。TaMADS#11是TaVRT-1的一个同源基因，同样具有促进营养生长向生殖生长转变的功能。WP11和WP12是小麦中分离出来的两个与心皮化有关的基因，表达部位集中在小花浆片原基和雄蕊原基，该基因属于B组PI亚家族基因。TaMADS#82是一个与WP11表达模式相似的基因。此外发现，WAG基因与小麦幼穗发育有关，VRNl和VRN2基因与小麦开花结实相关。MADS-box基因的研究虽然有增多趋势，但在小麦中的研究仍处于起步阶段，对小麦幼胚脱分化过程的研究至今尚未见报道。 　　本试验用豫麦18幼胚为材料，在2，4-D诱导条件下进行脱分化处理，结合基因芯片技术，检测不同时间点MADS-box基因的差异表达情况，对揭示它们在小麦幼胚脱分化过程中的作用具有重要的参考意义。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　利用豫麦18作为试材，于小麦授粉后16 d采集幼穗在无菌条件下剥取幼胚，放置于MS+2，4-D（2 mg/L）培养基上进行培养，分别于脱分化处理0、2、6、12、24、72 h时取样，用液氮处理，-70%低温冰箱中保存备用。 　　1.2试验方法 　　1.2.1小麦幼胚总RNA的提取 总RNA的提取按QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒操作程序进行。总RNA纯化按QIAGEN公司的RNeasy mini试剂盒操作程序进行。用DEPC处理过的ddH20溶解RNA，琼脂糖凝胶电泳（180V，0.5 h）对总RNA 28S和18S比例进行检测，在260/280 nm波长下测定总RNA的吸光值，计算其浓度和纯度。 　　1.2.2小麦幼胚cDNA、cRNA的合成与纯化按照Affymetrix公司方法进行cDNA、cRNA合成。eDNA合成需取1～8μg总RNA作为模板。生物素标记的eRNA合成需取12μL上述eDNA溶液作为模板。按基因芯片分析样品纯化操作程序对cDNA、cRNA进行纯化。按1.2.1方法对cDNA、eRNA浓度、纯度和质量进行检测。1.2.3 　　小麦幼胚cRNA片段化和芯片检测 　　在1.5 mL无RNA酶、灭菌的离心管中加入浓度为1μg/μL的cRNA 15 μL，5×片段化缓冲液6 μL，无RNA酶水9μL，将体系混匀，94℃温浴35min，冰上放置，获得长度为35～200 bp的cRNA片段。杂交液的配制按Affymetrix公司提供的配方进行，再将其加入到经过预杂交处理的Affy―metrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min杂交16 h。采用全自动洗涤工作站450（Affymetrix公司，USA）对基因芯片进行洗涤和染色，采用高分辨芯片扫描仪3000（Affymetrix公司，USA）对