ShRNA靶向沉默STX8基因对U251细胞增殖和迁移侵袭影响.docVIP

ShRNA靶向沉默STX8基因对U251细胞增殖和迁移侵袭影响 　　[摘要] 目的 探讨敲低STX8基因对脑胶质瘤细胞瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响。 方法 构建STX8-shRNA-pSuper表达载体转染U251细胞，分别用CCK8法、划痕实验、Transwell实验检测细胞增殖、迁移侵袭能力。 结果 CCK8法、划痕实验、Transwell实验结果显示，STX8干扰后细胞增殖、迁移侵袭能力显著下降。 结论 STX8基因的敲低能有效抑制U251细胞增殖、迁移侵袭能力，STX8基因有可能成为胶质母细胞瘤基因治疗的新靶点。 　　[关键词] STX8基因；胶质细胞瘤；RNA干扰；U251细胞 　　[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（a）-0004-04 　　[Abstract] Objective To study the effect of knockdown STX8 gene on proliferation and migration of U251 cells. Methods STX8-shRNA-pSuper expression vector， transfected U251 cells were constructed， cell proliferation， migration and invasion ability were determined by CCK8 test， scratch test and transwell assay respectively. Results The cell proliferation， migration and invasion ability of STX8 interference group was significantly decreased. Conclusion Knockdown of STX8 inhibits the proliferation， migration and invasion ability of U251 cells， STX8 gene may be a new target for gene therapy of glioblastoma. 　　[Key words] STX8 gene； Glioma； RNA interference； U251 cell 　　脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一，目前临床治疗手段疗效有限[1-2]，需要迫切寻找其关键致癌因子。近年来，研究发现SNARE蛋白在肿瘤发生发展中发挥重要作用，其相关蛋白能否作为肿瘤治疗的分子靶点也受到了很多关注[3-5]。成员之一Syntaxin8（STX8）参与了胶质母细胞瘤的发展[3]。目前尚未有STX8在脑胶质瘤细胞中参与哪些细胞功能的研究，本文通过分析脑胶质瘤细胞株U251中STX8的作用，探讨其在脑胶质瘤中的发生发展和侵袭的意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　pSuper：OligoEngine公司，STX8抗体：BD Biosciences公司，β-tubulin抗体：Sigma公司，HEK293细胞为实验室保存，U251细胞系：中科院上海细胞库。 　　1.2 载体构建及筛选 　　将干扰序列溶解至3 μg/μL，取正反oligo各1 μL，溶于48 μL退火buffer。靶序列：1#GACCGAAGACAGAACCTCTTGCTC；2#ATACGATTCTACTTGTCAAATCTC。退火产物及载体（pSuper）酶切、连接、转化、测序。使用测序成功的2个pSuper-STX8干扰质粒（1#，2#）分别转染HEK293细胞，为pSuper-STX8干扰组。空载体作为阴性对照。 　　1.3 RT-PCR 　　收集pSuper-STX8干扰组和阴性对照组细胞提RNA，反转录 cDNA。STX8引物 F： 5?@-GAGGAGCCAGAGGAGACCAG-3?@，R：5?@-TAGAGGAAAGGGCATCAAGG-3?@；内参GAPDH引物F：5?@-CGGAGTCA-ACGGATTTGGTCGTAT-3?@，R：5?@-AGCCTTCTCCA-TGGTGGTGAAGAC -3?@。反应体系：模板cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，引物（F+R）0.8 μL+0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸30 s，40个循环。重复3次，2?CΔΔCt分析法进行分析。 　　1.4 Western blot 　　转