VEGF―AVEGFR―2信号通路对胃黏膜癌变过程新生血管调控作用.docVIP

VEGF―AVEGFR―2信号通路对胃黏膜癌变过程新生血管调控作用 　　[摘要] 目的 研究新生血管在胃病发展不同时期胃黏膜中的生成情况及血管内皮生长因子（VEGF）-A/血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2的调控作用。 方法 选择2012年1～12月上海长征医院胃镜室收集非癌变胃黏膜组织（包括慢性胃炎、胃息肉、胃溃疡、肠腺化生）及病理科收集胃癌组织（包括癌组织、癌旁近端、癌旁远端）各20例。采用免疫组化SP法检测微血管密度（MVD）；Western Blot及RT-PCR法检测VEGF-A/VEGFR-2的表达。 结果 新生血管在慢性胃炎、胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生、胃癌不同区域的表达存在差异，其中，在胃炎胃黏膜中新生血管相对稀疏，而胃息肉、胃溃疡和胃黏膜肠腺化生新生血管稍密集，胃癌新生血管明显密集，有形成血管腔形状。总体上，MVD随着组织恶性转化倾向存在递增趋势，胃炎低于胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生、癌旁远端，低于癌旁近端，低于胃癌（P 0.05）。VEGF-A/VEGFR-2对新生血管存在明显的调控作用，其表达和MVD变化高度一致。 结论 微血管生成贯穿在胃黏膜病变不同时期，VEGF-A/VEGFR-2信号通路对新生血管具有调控作用，抑制微血管生成可能具有阻断胃黏膜恶性病变的意义。 　　[关键词] 胃黏膜癌变；新生血管；血管内皮生长因子-A；血管内皮生长因子受体-2 　　[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（a）-0011-04 　　大量研究表明，新生血管生成对肿瘤的生长和转移具有重要作用[1]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路是调控新生血管的关键信号通路，其中，血管内皮生长因子（VEGF）-A和血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2被认为和肿瘤微血管生成密切相关[2]。研究证实，在结肠癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[5]等肿瘤中均发现微血管密度（microvascular density，MVD）平均值随着TNM分期逐步增高。李学成等[6]、田小林等[7]发现胃癌组织中VEGF-A阳性率明显高于正常组织。但胃癌发生发展过程中可能经历的不同阶段胃黏膜微血管生成情况及与VEGF-A/VEGFR-2的关系少见报道。为此本研究采用免疫组化SP法检测MVD，Western Blot及RT-PCR法检测VEGF-A/VEGFR-2的表达，研究VEGF-A/VEGFR-2信号通路与新生血管变化规律，现报道如下： 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　2012年1～12月于上海长征医院胃镜室，取慢性浅表性胃炎、胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生各20例标本；于病理科取胃癌标本，包括癌组织、癌旁近端、癌旁远端，各20例。癌旁近端组织为取自距胃癌组织边缘3～5 cm胃黏膜组织，癌旁远端组织为取自距胃癌组织边缘5 cm外胃黏膜组织，病理证实均无肿瘤细胞浸润。入选标准：①慢性浅表性胃炎、胃息肉、胃溃疡、胃黏膜肠腺化生符合修订版悉尼系统[8]诊断标准；②胃癌诊断标准参考文献[9]；③排除放化疗病例；④研究方案经伦理委员会批准，患者对受试内容完全了解，并签署知情同意书。 　　1.2 主要试剂 　　一抗：CD34 antibody（1∶100，Abcam），Anti-VEGFA antibody、Anti-VEGF Receptor 2 antibody（1∶1000、Abcam）；BCA蛋白定量试剂盒（索莱宝）；逆转录试剂盒（Promega）；鼠兔通用型超敏二抗PV9001、DAB显色液（中杉金桥）；中性树胶、苏木精染液、PMSF裂解液（国药）；PCR反应液（Transistor）；Trizol试剂、引物（Invitrogen公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 免疫组织化学SP法 　　免疫组化SP法常规脱蜡，水化，除去内源性的过氧化氢酶，抗原修复，血清封闭，加1∶100一抗，湿盒中于4°C冰箱中保存过夜，PBS洗5 min×3次，加二抗，湿盒中于37°C温箱中0.5 h，加DAB显色剂，水洗终止显色，苏木精复染，逐级酒精脱水，中性树胶封片，晾干拍照。用已知阳性的组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。每一批实验均设有阳性、阴性对照。 　　微血管计数参考Weidner等[10]的方法。①CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准；②微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数，只要结构不相连，其分支结构也作为1个血管计数；③低倍镜（100×）下观察切片，选择微血管分布最高密度区，然后在高倍镜（200×，每个视野面积为0.785