siRNA抑制PTTG1表达对人脑胶质瘤细胞增殖侵袭性影响.docVIP

siRNA抑制PTTG1表达对人脑胶质瘤细胞增殖侵袭性影响 　　【摘要】目的构建针对人脑胶质瘤细胞系的高效沉默PTTG1的RNAi载体；探讨PTTFG1 siRNA干扰质粒对人脑胶质瘤细胞系U373增殖、侵袭性的影响。方法设计三对PTTG1基因干扰序列，合成能够特异干扰PTTG1的siRNA，然后将其与pGenesil2载体连接，构建pGenesil2-PTTG1 siRNA干扰载体，在脂质体作用下将PTFG1 siRNA质粒转染至胶质瘤U373细胞后，用RT-PCR和Western blot方法检测PTTG1 mRNA及蛋白表达水平的变化，通过细胞增殖实验、划痕实验和Transwell小室实验检测PTTG1对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果在胶质瘤U373细胞转染3个不同的siRNA片段干扰PTTG1的表达，RT-PCR检测结果显示，PTFG1 siRNA1干扰质粒对PTFG1表达的抑制作用最明显[（0.47±0.12）vs（1.00±0.15），P0.01]。转染PTFGl siRNA质粒的胶质瘤细胞U373在48h和72h细胞增殖能力均显著低于对照组。细胞划痕实验显示干扰PTTGl可明显缩短U373细胞的迁移距离；Transwell小室结果显示干扰PTTG1后U373的穿膜细胞百分率明显下降[（58.00±8.72）%vs（36.3±7.76）%，P0.05]。结论PTTG1 siRNA干扰质粒可明显抑制胶质瘤U373细胞PTTG1的表达，并可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力。 　　【关键词】垂体肿瘤转化基因；RNA干扰；胶质瘤；侵袭 　　【中图分类号】R739.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-0616（2015）21-09-05 　　脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，目前以手术治疗为主，辅以放疗及化疗等综合治疗，但是由于胶质瘤的恶性程度高，呈浸润性生长，与周围正常脑组织无明显分界，易于复发，并随着复发次数的增加其恶性程度也会不断增加。因此，临床疗效仍不理想。目前胶质瘤研究的重要任务是研究与胶质瘤恶性进展相关的基因，为胶质瘤的诊断和治疗寻找新的途径。垂体肿瘤转化基因（PTTG）是1997年，Pei等在大鼠垂体肿瘤组织中发现的，其中PTTG1是在MG63骨肉瘤细胞中被发现能够抑制分离酶的活性，使姐妹染色体分离受阻，增加使细胞突变机率，从而导致肿瘤的发生发展。PTTG1基因在大多数恶性肿瘤及内分泌相关性肿瘤中均有较高表达，目前研究认为PTTG1基因与抑制染色体分离密切相关，还参与了血管生成，在肿瘤的发生发展及侵袭转移中起到重要作用。本课题组在前期研究中已经证实PTTG1在人脑胶质瘤细胞中的表达较正常脑组织明显增强，并与胶质瘤的恶性程度呈正相关。在本研究中我们应用RNA干扰技术，构建高效沉默PTTG1的siRNA干扰质粒，并将其转染入胶质瘤细胞U373中，探讨其对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭性的影响。 　　1材料与方法 　　1.1实验材料 　　胶质瘤细胞株U373（ATCC编号：HTB-17），第5～8代细胞用于做细胞学实验，DMEM培养基，胎牛血清，大肠杆菌DH5α感受态细胞（购于天根生化有限公司），质粒Pgenesil 2（购买于武汉晶赛生物工程技术公司），RT-PCR试剂盒，鼠抗人PTTG1单克隆抗体（购于美国Santa Cruz公司）。 　　1.2实验方法 　　1.2.1胶质瘤细胞的培养 胶质瘤细胞株U373用DMEM培养基（含10%胎牛血清）传代培养，培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。细胞生长状态良好时进行实验，转染PTTG1干扰质粒的细胞作为实验组，转染非干扰质粒的细胞作为对照组，每种实验方法均选用同一批次细胞进行。 　　1.2.2重组Pgenesil2 PTTG1 siRNA的构建及鉴定 　　根据Genbank提供的PTTG1 cDNA序列（NM-004129），应用Ambion在线设计软件筛选出三条PITG靶基因序列，分别为PTTG-1：TGGGAGAqL3UAAGTIqEA；PTFG-2：GTCTGTAAAGAC CAAGGGA；PTTG-3：GCATFCTGTCGACCCTGGA，根据上述靶序列设计出三对PTTG1干扰序列。 　　pGenesil2质粒经BamH I和HindⅢ双酶切，用1%琼脂糖凝胶回收大片段。将上述合成的寡核苷酸片段溶解于退火缓冲液（50μL），分别取正链（2μL）、反链（2μL）和退火缓冲液（16μL），混匀，94℃水浴，3min，自然冷却至室温。用去离子水（99μL）稀释退火产物（1μL），4℃保存。取稀释后退火寡核苷酸链（1μL），Pgenesil2质粒载体（1μL），10×Ligase Buffer（1μL），加入T4连接酶（1