PD―ECGF在CEA术后再狭窄血管中表达及其与管腔狭窄程度相关性研究.docVIP

PD―ECGF在CEA术后再狭窄血管中表达及其与管腔狭窄程度相关性研究 　　【摘要】 目的 探讨血小板衍生内皮细胞生长因子（PD-ECGF）在颈动脉粥样硬化剥脱术（carotid endarterectomy， CEA）术后再狭窄血管中的表达及其与管腔狭窄程度的相关性。方法 20只新西兰清洁级白兔， 随机分为对照组（5只）和实验组（15只）， 建立兔颈动脉再狭窄模型， 取材后行免疫组织化学染色， 与对照组相比， 观察实验组PD-ECGF的表达， 并观察其阳性表达强度与管腔狭窄程度的关系。结果 实验组PD-ECGF阳性表达（2分）13例， 阴性（≤2分）2例， 对照组阳性表达3例， 阴性12例， 对比差异有统计学意义（P0.01）；PD-ECGF阳性表达强， 其管腔狭窄程度较轻， 表达较弱时则相反。结论 PD-ECGF可能是血管再狭窄形成诸多因素中的一种起保护作用的因子， 可促进内皮细胞的迁移， 从而抑制血管平滑肌的增殖。 　　【关键词】 血小板衍生内皮细胞生长因子；颈动脉粥样硬化剥脱术；再狭窄血管 　　CEA是预防和治疗缺血性脑卒中的主要手术方式， 但术后仍有再狭窄的发生， 周定标[1]报道发生率为1%～31%， 如何有效的预防已成为困扰临床医生的一大难题。PD-ECGF是血小板中发现的一种内皮细胞生长因子， 本研究通过对20只新西兰白兔进行分组实验， 从而探讨该因子在CEA术后再狭窄血管中的表达及其与管腔狭窄程度的相关性， 现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 新西兰清洁级白兔20只， 随机分为对照组（5只）和实验组（15只）。其中对照组给予正常喂养6周后取材， 每只在颈动脉不同部位取3份， 共15份标本作为对照；实验组给予高脂喂养2周， 形成斑块后行CEA术， 术后继续高脂喂养4周， 待再狭窄形成后取材。 　　1. 2 仪器与试剂 手术显微镜及显微器械， 爱惜康可吸收缝线， LipofectamineTM2000；地高辛精（Dig-11-ddUTP）；PD-ECGF单克隆抗体；携带PD-ECGF质粒的克隆；大肠杆菌DH5a；分子克隆工具酶；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；质粒抽提试剂盒；SP试剂盒；分析醇。 　　1. 3 方法 ①实验组颈动脉再狭窄模型建立方法：给予1 g胆固醇/（d?只）， 喂养2周。用3%戊巴比妥钠3 mg/kg， 耳缘静脉麻醉。颈部剃毛， 于甲状软骨下1 cm处， 沿颈白线切开皮肤约4 cm， 用显微剥离子在动脉壁中膜层分离， 完整切除已分离的内膜， 用缝合线连续缝合动脉切口， 缝合后动脉直径应不低于原血管直径的85%， 用不含肝素的生理盐水充盈管腔， 放开血管夹， 检查无明显出血后， 将颈总动脉放回原位， 缝合颈阔肌和颈部皮肤切口。生存动物术后继续给予高胆固醇喂养4周。②血管标本的制备：术后实验组高脂喂养4周， 麻醉试验动物后在无菌条件下锐性切下狭窄处血管约1.5 cm， 置冰上用肝素盐水冲洗管腔内血液， 4%多聚甲醛固定。③原位杂交组织化学染色检测PD-ECGF的阳性表达：用Dig-11-ddUTP修饰合成好的寡核苷酸探针并纯化。将各组石蜡包理切片浸入二甲苯10 rain移除石蜡， 用30 ?l 0.4 ng/?l的PD-ECGF mRNA的寡核苷酸探针液加在切片上， 过夜；滴加酶标地高辛抗体（1：500）， 37℃30 min；加显色液后显色；二甲苯透明， DPX封固。④病理学检查：取血管组织0.25 cm， 将其连续切片， 厚度为0.4 ?m， 行苏木素-伊红（HE）染色， 计算机病理图像分析系统下观察管腔狭窄率=（1-现存管腔面积/内弹力膜以下面积）×100%。根据NASCET狭窄程度分级：轻度30%， 中度30～69%， 重度70～99%。 　　1. 4 判定标准 显微镜下观察， 阳性信号为紫蓝色颗粒状沉淀物分布于细胞浆中， 计数显微高倍视野中阳性表达， 强度评分标准：无染色记0分；轻度染色记1分；中度染色记2分；强染色记3分。细胞比例评分标准：无染色记0分；50%染色记3分。评分之和2分， 则为PD-ECGF表达阳性， ≤2分则为阴性。 　　1. 5 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P0.05表示差异具有统计学意义。 　　2 结果 　　实验组无染色1例， 轻度染色1例， 中度染色2例， 强染色11例；细胞比例：无染色1例， 50% 8例。对照组无染色13例， 轻度染色1例， 中度染色1例， 无强染色；细胞比例：无染色13例；25%染色。实验组阳性表达（2分）13例， 阴性（≤2分） 2例； 对照组阳性表达3例， 阴性12例， 比较差异有统计学意义（χ2=13.39， P0.01）。对实