PTK787对K562细胞增殖及细胞周期作用影响.docVIP

PTK787对K562细胞增殖及细胞周期作用影响 　　【摘要】 目的：观察酪氨酸激酶抑制剂PTK787对K562细胞增殖、细胞周期的作用，探讨PTK787抗急性髓系白血病的作用机制。方法：应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）观察不同浓度PTK787在不同时间对K562细胞增殖作用的影响；用流式细胞仪检测浓度PTK787对K562细胞周期的抑制作用。结果：随着PTK787浓度增加与作用时间延长，K562细胞的增殖抑制率逐渐升高。同一时间不同浓度组之间比较，或者同一浓度不同时间组间比较，差异均有统计学意义（P0.05），其中PTK787作用48 h，以浓度320 μmol/L对细胞抑制率最强。随着PTK787浓度增加，G1期细胞比例逐渐升高，S期细胞比例逐渐下降，各组间比较差异有统计学意义（P0.05）。结论：PTK787可以抑制K562增殖，阻止K562细胞由G1期向S期转化，从而达到抗白血病的作用。 　　【关键词】 酪氨酸激酶抑制剂； 白血病； K562细胞； PTK787； 细胞增殖 　　酪氨酸激酶（PTKs）是一种新型血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制酪氨酸激酶的磷酸化，阻断信号传导、酪氨酸激酶的过度激活导致其下游信号途径的激活，最终导致细胞的转化、增殖和抵抗细胞凋亡、促进细胞生存，进而与肿瘤发生、发展、预后与转归密切相关。其抑制剂中的一种PTK787可抑制多种实体肿瘤细胞的生长，已有研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[1]。本实验利用PTK787作用于K562细胞，研究其对K562细胞增殖、细胞周期的作用，以进一步探讨PTK787抗白血病细胞的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 人慢性粒细胞白血病急变期K562细胞株，购于中国科学院上海细胞库。酪氨酸激酶抑制剂PTK787由瑞士诺华公司惠赠。MTT购于美国Sigma公司。RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 K562细胞在含10%小牛血清，100μmol/L的青、链霉素的RPM1640培养液中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于各项实验。 　　1.2.2 PTK787对K562细胞增殖作用的细胞形态学观察 使用分别加入10 μl不同浓度的PTK787作用K562细胞48 h后，在倒置显微镜下观察细胞生长变化情况，并拍照。 　　1.2.3 MTT法检测PTK787对K562细胞的增殖作用 取对数生长期、生长良好的白血病K562细胞用于实验，调整各组细胞浓度为1×104个/ml，每组设3个复孔。各实验组加入含10 μl不同浓度PTK787的细胞培养液。接种完毕后在37 ℃，5% CO2条件下孵育培养12、36、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）10 μl，混匀后37 ℃，5% CO2条件下孵育4 h，加入三联细胞裂解液（SDS 10 g，异丁醇5 ml，10M HCl 0.1 ml用双蒸水溶解配成100 ml溶液）100 μl，37 ℃温育12～20 h，用丹尼酶标仪检测各组细胞的吸光度，测定波长为570 nm。细胞抑制率=1-（实验组光密度-空白对照组光密度）/（阴性对照组光密度-空白对照组光密度）×100%。 　　1.2.4 流式细胞仪检测PTK787对K562细胞周期作用 6孔板每孔加入等量细胞以及10 μl不同浓度的PTK787，培养48 h，冷PBS洗涤离心2次，弃PBS。用70%冰乙醇固定12 h，调整细胞浓度1×106个/ml；用冷PBS洗涤2次，弃PBS。加入PI染液0.6 ml，避光染色半小时后上流式细胞仪检测。打印DNA含量直方图，自动拟合细胞周期各时相比例。重复5次。 　　1.3 统计学处理 使用SPASS 13.0统计软件进行统计描述，本实验数据资料以（x±s）表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较根据方差齐性检验，当总体方差齐同时选择LSD法；当总体方差不齐时，选择Tamhane T2法，P0.05表示差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 PTK787对K562细胞增殖作用情况的细胞形态学观察 以下为不用浓度PTK787作用K562细胞48 h后相差显微镜下细胞生长变化图。阴性对照组为生长48 h的K562细胞：细胞生长旺盛，形态规则，密集平铺在培养板。加入不同浓度的PTK787作用细胞48 h，且药物浓度逐渐升高，发现细胞生长明显受抑制，细胞数量、形态均有改变，呈浓度相关性。见图1。 　　2.2 PTK787对K562细胞增殖的作用 不同浓度的PTK787作用于K562细胞12、36、48、72 h后，用MTT法检测结