Exendin―4干预对2型糖尿病肾病大鼠肾组织HO―1表达影响.docVIP

Exendin―4干预对2型糖尿病肾病大鼠肾组织HO―1表达影响 　　摘要：目的 观察Exendin-4干预对糖尿病肾病（DN）大鼠肾组织NT和HO-1蛋白和mRNA表达的影响。方法 高糖高脂饲料结合链脲佐菌素（40mg/kg）建立DN大鼠模型，随机分为DN组、低剂量干预组和高剂量干预组，并与正常大鼠比较，免疫组化法观察NT和HO-1蛋白表达的变化，RT-PCR法观察mRNA表达的变化。结果 HO-1主要在肾小管上表达。与正常大鼠相比，DN组HO-1表达显著降低（P0.001）；经Exendin-4低剂量干预和高剂量干预后HO-1表达显著增加（P0.001）。结论 Exendin-4通过增强HO-1表达进而降低氧化应激以保护DN大鼠肾脏。 　　关键词：糖尿病；肾病 　　2型糖尿病（diabetes mellitus， DM）是一种慢性遗传相关性疾病，后期常合并糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）等微血管并发症，极大的增加了患者残疾和死亡的风险[1，2]。当前认为，DN的发病和进展是在遗传学背景的基础上，肾组织糖脂肪代谢紊乱、氧化应激等多因素综合作用的结果[3]。血红素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）由氧化应激诱发[4]，是血红素分解代谢过程中的限速酶，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化和抗增值等细胞保护作用[5]。课题组前期发现GLP-1类似物Exendin-4通过降低免疫炎性反应和延缓纤维化进程进而保护DN大鼠肾脏，而尚未阐明氧化应激机制是否参与Exendin-4的肾脏保护作用。为此，我们建立大鼠DN模型，制备肾脏组织切片，观察Exendin-4干预对HO-1 蛋白和mRNA表达的影响，以阐明Exendin-4保护肾脏的潜在氧化应激机制。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 ♂SD大鼠40只（山西医科大学实验动物中心），200～220g。链脲佐菌素（Sigma-Aldrich），Exendin-4针剂（东莞宝丽健）。兔抗鼠HO-1多克隆抗体（北京博奥森），DAB染色试剂盒（北京博奥森），RNA提取试剂盒（北京康为世纪）。BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟）。 　　1.2方法 　　1.2.1 2型DN模型大鼠的构建 30只大鼠适应性喂养1w后，给予高脂高糖饲料喂养4w，第5w结束时依大鼠体重腹腔注射链脲佐菌素（40mg/kg），第6w结束时测尾静脉随机血糖浓度（16.65mol/l提示DM建模成功）。第10w结束时收集24尿量，测24h尿微量白蛋白含量（30mg/（kg?d）提示DN建模成功，成功率80%）。整个建模期间，均不使用降糖药物；并将DN大鼠随机分为无干预组、Exendin-4低剂量干预组和高剂量干预组，每组8只。8只正常大鼠作为对照组，常规饲料喂养10w。 　　1.2.2 Exendin-4干预方法 DN建模成功后次日，低剂量干预组皮下注射4μg/（kg?d）的Exendin-4，高剂量干预组给予20μg/（kg?d）的Exendin-4，连续给药6w。监测体重1次/w，依据体重变化调整药物剂量。 　　1.2.3留取肾组织标本 大鼠断头处死，立即取出双侧肾脏。左肾置于4%的多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋切片，行免疫组化研究；右肾置于冻存管中并在超低温冰箱中保存，行RT-PCR研究。 　　1.2.4 HO-1蛋白表达（免疫组化法） 石蜡切片脱蜡至水，H2O2室温孵育以消除内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗5min×3次，高压热修复组织抗原，山羊血清封闭，滴加兔抗大鼠HO-1抗体（1：50稀释）、4℃过夜，PBS缓冲液冲洗、滴加辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG，PBS缓冲液冲洗、DAB显色、苏木精复染，封片保存。显微镜下观察：HO-1阳性表达体现为细胞浆呈棕黄色或棕褐色。BI-2000医学图像分析系统观察五个视野，并计算视野中阳性表达的平均灰度值。 　　1.2.5 HO-1mRNA表达（RT-PCR法） 剪取肾组织50mg，按照经典法[6]依次加入Trizol（1ml）、氯仿（200μl），异丙醇（与上清液等体积）提取总RNA。按照试剂盒说明进行逆转录和扩增，反应体系20μl，PCR反应条件：94℃预变性10min，活化Tag酶；PCR反应94℃15s，延伸60℃60 s，45个循环结束。引物序列由上海生工生物科技有限公司合成，β- actin：上游5-GTC AGG TCA TCA CTA TCG GCA AT- 3，下游5-AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CGT- 3，产物长度147bp；HO-1：上游5-CAC GCA TAT ACC CGC TAC CT- 3，下游5 -AAG GCG GTC TTA GCC TCT TC