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RAPD技术在石榴品种分类上应用 　　摘 要：以55个石榴栽培品种为试验材料，利用15条多态性好的随机引物进行RAPD分析，共扩增出125条带，其中多态性条带92条。多态性百分率73．6％，说明品种间有变异。应用TFPGA软件计算55个石榴品种间的Nei’s遗传距离，并用UPCMA法构建聚类图，将55个石榴品种分为4个类群，从DNA水平上揭示了石榴品种之间的亲缘关系。结果表明，采用UPGMA法聚类的结果与形态上的分类存在着一定的差异，即与根据花色和果味进行的分类没有相关性而与瓣型进行的分类有一定的相关性。 　　关键词：石榴：品种；分类；RAPD 　　中图分类号：$665．4 文献标识码：A 文章编号：1009-998(2007)05-634-06 　　 　　石榴(Punica granatum L)又名安石榴、丹若、金罂、天浆等，为多年生落叶果树，原产伊朗和阿富汗等中亚地区，在我网已有超过2000 a的栽培历史，是我国古老的栽培果树之一，具有较高的食用、药用及观赏价值。 　　我国石榴品种资源十分丰富，但由于长期的引种和选择，已很难从植物的外部形态上来确定品种的来源和品种问的亲缘关系，存在着同名异种或同种异名的问题，这给准确进行品种资源鉴定和利用带来了困难。目前对石榴的研究基本停留在形态学水平上，对石榴品种资源的分类还没有统一的方法，各地多以果型大小、果皮色泽、籽粒风味、籽粒口感、成熟期及用途等进行分类。因此。利用分子标记等先进手段进行品种分类已成为一个重要的研究方向。RAPD技术是进入20世纪90年代后发展起来的一种DNA分子标记技术，被广泛用于植物品种的鉴定和分类。但应用该技术对石榴品种分类研究的报道较少。我们利用RAPD技术对石榴品种进行研究。以期建立分子水平上的石榴分类体系，分析不同品种间的遗传关系，为石榴品种的鉴定提供依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1材料 　　选取不同花色和花型的55个石榴品种为材料(表1)，采集新鲜、无虫斑的幼嫩叶子，用硅胶干燥保存。用于基因组提取和RAPD分析。 　　 　　1．2方法 　　1．2．1 DNA的提取每样取0.1 g左右，利用改进的CTAB法提取总DNA．溶于1×TE缓冲液中备用。用质量分数0.8％的琼脂糖凝胶电泳，以LambdaDNA/HindlII Marker为对照．确定各样品的分子质量大小。并且用UV/VIS分光光度计测定纯度，然后将基因组DNA稀释成一定浓度，保存在-20℃冰箱中备用。 　　1．2．2随机引物的筛选利用180条上海生工提供的10碱基随机引物，进行PCR扩增，选择了品种问存在多态性和扩增效果好的15条引物用于模板扩增。这些引物的编号及碱基序列见表2。 　　 　　1．2．3 PCR及电泳采用上海生工10碱基引物，天为时代公司的dNTP，宝赛公司的Taq DNA聚合酶。反应在德国产的Eppendorf梯度PCR仪上进行。反应体系为25 IxL，其中模板为50 ng、Taq酶1.25 u、dNTP 0.2 mmol/L、引物0.3 μmol/L、MgCL22 mmol/L。扩增程序为94℃预变性5 min；然后94℃，30 s；36℃，45 s；72℃，1.5 min为1个循环，扩增40个循环，最后在72℃下延伸7 min。扩增产物在质量分数1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳和凝胶用50xTAE缓冲液，EB染色，而后在紫外灯下观察多态性，并用Polaroid胶片拍照。 　　l.2．4数据处理 以100 bp DNA作分子质量对照，有带记为1，无带记为0，获得0、1二元数据矩阵。用TFPGA软件计算55个石榴品种间的Nei’s遗传距离，并用UPGMA法构建聚类图。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1 DNA扩增结果 　　从120条随机引物中筛选出15条扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物。从全国各地采集的55个石榴品种作为研究对象进行PCR扩增，共扩增出125个位点，其中92个为多态性位点，多态性位点的百分率为73．6％(表2)，每条引物扩增条带数范围从4-13。引物$66、$2085扩增的结果分别如图1、图2。 　　 　　 　　2．2品种聚类分析 　　根据RAPD多态性位点计算的遗传距离范围在0.088 9～0.980 8(图3)。平均遗传距离0.300，其中3与20之间的遗传距离最大为0.9808，它们的花色都为红色，花型为单瓣；26与27之间的遗传距离最小为0.0889，它们的花色为红色，花型：26为重瓣，27为单瓣。 　　 　　依据遗传距离应用UPGMA建立了55个石榴品种的聚类图(图3)。根据聚类图，在遗传距离4.0处，将55个石榴品种分为4个类群(A、B、C、D)。其中单瓣、花