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SCAR标记在地木耳菌株分类鉴定中运用 　　摘要：基于相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）建立地木耳菌株的特定序列扩增（sequence characterized amplified regions，SCAR）标记。通过随机引物组合筛选获得EM18-ME7作为SRAP标记引物，扩增地木耳基因组后获得1.2 kb大小的特异性条带，经克隆、测序，根据测序结果利用Primer 5.0软件设计出2对特异性引物，其中引物F-9-F1、F-9-R1经SCAR-PCR扩增出约1.1kb大小的特异性片段，说明成功构建了“菌株3”的指纹图谱。 　　关键词：SRAP；SCAR；地木耳；分类鉴定；指纹图谱；快速鉴定；种质资源分类 　　中图分类号： S646.602 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）09-0064-03 　　地木耳（Nostoc commune Vauch）俗称地皮菜、地耳、地软、地衣、地捡皮等，是一种固氮型蓝细菌，属细菌界蓝细菌门念珠蓝细菌属光能自养微生物，在全国广泛分布，特别适宜在潮湿阴暗处生长。地木耳富含蛋白质、多糖、维生素等，特别是蛋白质含量占干质量的20%以上，营养价值极高[1-2]，中国多地均有将其入菜的习惯。已有研究发现，地木耳提取物还具有一定的抗氧化、抑菌以及提高免疫力的功效，甚至具有抑制老年痴呆以及抗肿瘤的功效，《本草纲目》《中国药典》亦记载了地木耳的药用价值[3-4]。这主要是由于地木耳中的黄酮、多糖、藻蓝蛋白等活性成分在起作用，研究人员分别对这些物质的理化性质及分离提取进行了研究。刁毅等发现从地木耳中提取的脂溶性物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等6种细菌有较好的抑制作用[5]；钱森和等研究同样证明了地木耳提取物对常见微生物具有较好的抑制作用[6]。张唐伟等通过研究地木耳多糖的抗氧化作用，发现其对?OH、DPPH自由基有较强的清除作用，但对O-2[KG-*2]? 和亚硝酸盐的清除作用较小；同样，该研究也发现，地木耳多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等微生物有一定的抑制作用[4]。Ploutno等发现，地木耳的活性物质具有抑制人鼻咽癌及直肠癌肿瘤细胞的效果[7-8]。张唐伟等采用L9正交试验研究时间、液料比、温度对地木耳多糖提取的影响，得到最佳提取工艺：控制温度为90 ℃、液料比60 mL ∶1 g的条件提取5次，提取时间为3 h，得率可达13.75%[9]。厉荣玉等通过研究得到地木耳总黄酮提取的最佳工艺：控制温度为80 ℃、乙醇浓度为70%、料液比为1 g ∶20 mL的条件下提取2次，提取时间为2.5 h，得率可达6.84%[10]。梁文裕建立了通过盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析的分离纯化地木耳藻蓝蛋白α、β亚基的程序[11]。李三相等利用羟基磷灰石的柱层析以及盐析、透析的方法分离得到地木耳的藻蓝蛋白[12]。 　　由此可见，地木耳是一种很好的食品开发资源。李贤煜等研发出普通型地木耳蛋白饮料、酸性地木耳蛋白饮料2种配方[13]；张宗舟开发了辣味地木耳酱，具有口味好、营养价值高等特点[14]。 　　地木耳虽然分布广泛，但是对生长环境要求较为严苛，野生资源难以满足市场需求，阻碍了其大规模开发。因此，部分学者对地木耳的人工栽培进行了研究。王东明等通过研究打浆后的地木耳在一定条件下的栽培情况发现，浆体所含的片段可逐渐恢复生长[2]。邓中洋等研究跑道式培养池规模化培养地木耳结果表明：在适宜条件下，可以实现地木耳的人工栽培[15]。同时，利用地木耳对环境因素敏感的特点，地木耳可以运用到环境污染的监测中。杨学山等利用地木耳挂袋法监测大气SO2污染[16]；马骥等利用地木耳的pH值监测大气污染的试验[17]均证明此观点。 　　目前，地木耳在分子标记方面的研究很少，仅有赵惠玲等利用随机引物及简单重复序列区间（ISSR）引物初步研究地木耳的分子生物学特性[18]。特定序列扩增（sequence characterized amplified regions，SCAR）分子标记有别于传统的分子标记技术，具有遗传一致、序列已知、高效且重复性好等特点，已经广泛运用到黑木耳[19]、棉花[20]、草鱼[21]等抗病育种以及分类鉴定中。本研究拟通过基于相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）分子标记的SCAR标记技术建立地木耳菌株的指纹图谱，为地木耳菌株的快速鉴别、种质资源分类等提供便利。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 地木耳菌株 供试地木耳菌株由丽水职业技术学院王东明老师提供，共10株，具体特征见表1。 　　1.1.2 仪器