三氧化二砷对人大细胞肺癌NCI―H460细胞凋亡影响研究.docVIP

三氧化二砷对人大细胞肺癌NCI―H460细胞凋亡影响的研究 　　摘要：目的 研究在临床上，三氧化二砷（As2O3）对人大细胞肺癌（NCI-H460细胞）细胞增殖、凋亡的影响，以探讨新的肺癌治疗方法。方法 配制NCI-H460细胞的细胞悬液（浓度为5×104个/mL），给予不同浓度的As2O3干预，并将其分为4组浓度分别为：10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L ，各组干预时间分别为24、48、72 h。细胞增殖抑制率通过MTT法检测，各组细胞形态学的改变通过镜下观察；细胞凋亡的形态学的变化通过原位末端标记法（TUNEL）检测，并与阴性对照组进行比较；按上述干预浓度及干预时间，使用流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果 As2O3对NCI-H460细胞增殖的抑制率随时间延长和浓度增加而增加（P0.05）， 凋亡指数随时间延长和浓度增加而增加 （P0.05）。结论 As2O3可抑制NCI-H460细胞增殖，诱导其凋亡，且呈时间、剂量依赖性。 　　关键词：三氧化二砷；大细胞肺癌；NCI-H460细胞；细胞增殖；细胞凋亡 　　三氧化二砷，分子式为As2O3，别名：砒霜，是具有代表性的砷化合物，主要用于治疗胃癌，胰腺癌、梅毒、结核等[1]，并在治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）过程中有着显著的疗效[2]。因其缓解率高， 和其他抗癌药物无交叉反应性，无骨髓抑制和严重毒副作用而获得了广泛重视，并被美国FDA批准用于APL的治疗。临床研究表明，As2O3对实体肿瘤如肺癌（A549?胞）、胰腺癌、胃癌等具有良好的抗癌作用。国内外报道多见应用As2O3作用于多种肺癌细胞方面，如Anip973细胞、NCI-H69细胞、A549细胞的凋亡，但是很少见到有关As2O3诱导NCI-H460细胞凋亡的报道，继而本实验选择NCI-H460细胞，观察As2O3对该细胞增殖及凋亡方面的影响，为临床上寻找对该类肿瘤新的治疗方法，提供理论依据。 　　1 资料与方法 　　1.1 细胞 NCI-H460细胞 （由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供）。 　　1.2试剂 As2O3（哈尔滨伊都药业）细胞凋亡检测试剂盒（瑞士Roche 公司）；RPMI-1640培养液、 胎牛血清（美国HyClone公司）。 　　1.3仪器 Bio-Rad 550 酶标仪（美国 Bio-Rad公司）；TS100倒置微镜 （日本Nikon公司）； JNOECXS-212-202生物显微镜 （南京江南光电集团股份有限公司）；流式细胞仪（BDFACSAria）。 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养 参见张小润、王晓宇等研究类似[3]。 　　1.2.2 MTT法测定As2O3对NCI-H460细胞的生长抑制率 显微镜下观察细胞，呈现对数生长期，0.25%胰酶消化成细胞悬液，离心1000 rpm/min、10 min，用含10%胎牛血清及青链霉素混合液的RPMI-1640全培养液稀释细胞浓度约5×104个/ml。将100 μl/孔的细胞悬液加入到96孔培养板中，共设4个平行组，每组设3个复孔，同时设1组阴性对照组（100 μl无药物干预的上述细胞悬液），5%CO2，37℃条件下培养24 h使细胞贴壁，然后每孔加入以生理盐水溶解的不同浓度的As2O3（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）50 μl，并向对照组加入细胞培养液50μl，设定24 h、48 h、72 h为上述5组的反应时间，带反应时间到达后，吸去原培养液并用生理盐水冲洗各孔，然后向各孔加入20 μl MTT，并于4 h后加二甲亚砜（DMSO）200 ul于每孔中，使用酶标仪测量吸光度OD（490 nm波长），对应3个复孔，反复3次实验每组浓度。细胞抑制率%=（1-给药组OD值/对照组OD值）×100%。 　　1.2.3细胞凋亡的形态通过原位末端转移酶标记法（TUNEL）法检测 同2.2操作得到细胞悬浮液5×104个/ml，将细胞悬液转到24孔板中培养，400 μl/孔，共设4个平行组，每组设3个复孔，同时设置1正常对照组孔（不加药），37℃，5% CO2条件下培养24 h使之贴壁，然后加入200 μl不同浓度的As2O3（生理盐水溶解），药物终浓度分别为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，分别作用24 h、48 h、72 h，到实验时间后，进行凋亡检测，具体步骤参见张小润、王晓宇等研究[3]。 　　1.2.4流式细胞仪检测细胞的凋亡指数 使用上述同样的方法将细胞浓度稀释至5×105/ml，将细胞悬液转到6孔板中培养，2 ml/孔，共设4个平行组，每组设3个复孔，同时设置1正常对照组孔（不