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不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响 　　[摘要]目的：了解不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响。方法：以骨髓基质干细胞(ma¨ow stromal cell s，MsCs)复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨，实验分为A组：组织工程骨用添加冻存保护剂的保存液保存；B组：组织工程骨用不添加冻存保护剂的保存液保存；c组：组织工程骨未行低温保存；D组：单纯Mscs培养。A组和B组的组织工程骨于一196℃的液氮中冻存3个月，3个月后复温冻存的组织工程骨。用倒置相差显微镜和扫描电镜观察Mscs的粘附和分布情况、检测细胞活力和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、流式细胞仪分析细胞周期。结果：Mscs在材料表面和孔隙内均可粘附和分布，粘附于材料的细胞活力大小依次为：c组A组B组 (PA组B组(PO．01)。各组细胞周期未见明显变化，未见异倍体细胞。结论：选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。 　　[关键词]组织工程；骨髓基质干细胞；脱蛋白骨；生物活性 　　[中图分类号]R318．08 [文献标识码]A [文章编号]1008―6455(2007)02―0147－04 　　目前，国内外骨库对于异体骨和异种骨的保存积累了丰富的经验，但对于组织工程骨的保存却是一个空白点。相对于异体骨和异种骨的保存，组织工程骨的保存需要更为严格的标准。如何使保存后的组织工程骨具有较好的生物活性，需要进行相关研究。 　　 　　1材料和方法 　　 　　1．1部分脱蛋白骨支架材料的制备：取脑死亡患者捐献尸体骨的干骺端，修整为1．5cm×0．5cm×0．3cm大小。材料一侧为皮质骨，另一侧保留部分松质骨，共24块。生理盐水反复冲洗，一70℃深低温冰箱冷冻后，经脱脂、脱细胞和部分脱蛋白处理，冷冻干燥机冻干。材料用双层血浆袋密封包装，环氧乙烷消毒，4℃冰箱冷藏保存。 　　1．2组织工程骨的制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1800r／min离心lOmin，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106／ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％C02饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含l×10-8mol／L地塞米松、50mg／L维生素C和l×10-2mol／L B-磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡l天后弃残液，每个支架材料以1×106／m1密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％C02饱和湿度培养7天。 　　1．3实验分组和组织工程骨的低温保存：实验分为A组：组织工程骨用添加冻存剂的保存液保存；B组：组织工程骨用不添加冻存剂的保存液保存；C组：组织工程骨未行低温保存；D组：单纯MSCs培养。以含15％胎牛血清DMEM培养液为基本保存液，冻存保护剂的基本成分为一二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、羟乙基淀粉和蔗糖，按照一定的比例合理搭配。具体降温步骤如下：将组织工程骨分装入含不同保存液的冻存管内，室温下放置10～15min，然后置于4℃ 20min，以－1℃／min降温至－20℃，保存30min，再以－1℃／min降温至80℃，隔夜后直接放入液氮中保存。3个月后取出冻存管，快速置于37℃水浴1～2min，直至保存液完全融化。 　　1．4倒置相差显微镜和扫描电镜观察：用倒置相差显微镜观察细胞与材料的粘附，细胞在材料孔隙内的分布。各组取组织工程骨1块，PBS漂洗三遍，戊二醛固定，酒精梯度脱水，标本经干燥和喷金处理后，用扫描电镜观察细胞在材料表面的粘附和分布。 　　1．5 MTT法检测细胞活力：各组取组织工程骨6块，于培养板中加入5mg／ml的MTT，反应4h后弃液，加入DMSO，振荡lOmin，用酶标仪(美国PerkinElmer公司)选择波长490nm读取光密度值(0D值)，分析细胞活力。 　　1．6 ALP活性检测：各组取组织工程骨6块，消化并收集细胞。采用对硝基苯磷酸法，用紫外／荧光／可见光高效分析仪(美国Perkin Elmer公司)测定ALP活性，了解细胞产生的ALP活性。 　　1．7流式细胞仪检测：各组取组织工程骨6块，消化收集细胞并计数，PI染液染色，用流式细胞仪(美国Coulter公司)检测细胞周期和DNA含量，计算DNA指数(DI值)。 　　1．8统计学方法：实验结果以x±s表示，采用SPSS10．0软件包对组间计量